離子色譜-脈沖安培法同時測定蔗糖酶和果聚糖酶活力的方法建立

劉忠瑩，王小平，陸 陽，何葉馨，王 鑫，黃韜睿

（1.四川省食品檢驗研究院，四川成都 610097；2.國家市場監管重點實驗室（白酒監管技術），四川成都 610097；3.四川旅游學院，四川成都 610100）

蔗糖酶（Sucrase，EC 3.2.1.26）又稱轉化酶，可以從果糖末端切開蔗糖的果糖糖苷鍵，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖[1-2]。果聚糖酶（Inulinase，EC 3.2.1.80）又稱菊粉酶，能夠水解β-2，1-D-果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，能使菊粉水解生成葡萄糖和果糖[3-5]。蔗糖酶與果聚糖酶的應用與生活密切相關，蔗糖酶廣泛應用于食品和發酵工業[6]，果聚糖酶廣泛用于生產高果糖漿[7-8]、生產酒精[9]、甚至可生產生物柴油的原料[10]、醫藥產氫、制備乳酸。菊粉酶還可直接發酵菊粉制備各種產品，如可制備丙酮丁醇，用于診斷腎臟疾病，控制血糖升高[11]等。此外，在兩種酶應用過程中發現存在同時使用的情況，如果聚糖含量測定[11]、應用菊粉生產酒精等領域，如能同時測定這兩種酶活力將大大節約分析時間。

酶活力的測定方法對確定酶活力的水平、酶特異性及歸類有著重要意義。目前關于蔗糖酶活力測定國內外采用的方法集中于3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法），如韓蕓嬌等[12]采用DNS法測定出面包酵母凍干粉中蔗糖酶活力；李勤[13]采用DNS法測定出海藻酸鈉包埋法固定啤酒酵母泥前后蔗糖酶活力；Liu等[14]調查15個不同樣地蔗糖酶隨季節變化的酶活性，也是用了DNS法。果聚糖酶活力測定方法主要是包括DNS法[15-16]、費林試劑熱滴定法、塞氏比色法、Somogi-Nelson法[17-18]等，以上測定蔗糖酶活力、果聚糖酶活力方法雖然對儀器設備要求低，檢測成本低，實用性好，但這些方法都會涉及有毒有害試劑的使用，比如DNS法[19-20]、Somogi-Nelson法中會用到高毒性的苯酚，滴定法中會用到易制毒試劑硫酸，塞氏比色法中會用到3類致癌物的間苯二酚等不利于實驗人員身體健康和環境保護的試劑，而目前檢測方法單一，還沒有出現創新新穎環境友好的酶活力測定方法。

本文采用蔗糖為底物，加入蔗糖酶后用硼氫化鈉將其水解產物葡萄糖和果糖還原成甘露醇和山梨醇，并將蔗糖酶高溫失活后加入果聚糖酶，再次得到水解產物葡萄糖和果糖；最后采用離子色譜-脈沖安培法測定甘露醇和山梨醇的總量來計算蔗糖酶的活力，測定葡萄糖和果糖的總量來計算果聚糖酶的活力，建立一種全新的環境友好的能同時測定蔗糖酶、果聚糖酶活力的方法,為酶活力的測定提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖、山梨醇 BePure公司；菊粉 阿達瑪斯試劑有限公司；蔗糖酶、果聚糖酶、葡萄糖、果糖德國Sigma公司；甘露醇 美國A Chemtek Inc 公司；50%氫氧化鈉溶液（色譜純） 賽默飛科技（中國）有限公司；乙酸鈉氫氧化鈉（色譜純） 美國ThermoFisher公司；馬來酸、硼氫化鈉、冰乙酸 均為分析純。

Dionex? ICS-5000+離子色譜儀（配有電化學檢測器）、Evolution201紫外-分光光度計、色譜柱CarboPaCTMPA20 250 mm×2 mm和CarboPaCTMPA1 250 mm×2 mm 美國ThermoFisher公司；SW22 恒溫水浴鍋 丹麥FOSS公司；MS3漩渦振蕩儀 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

本文部分色譜條件，蔗糖酶溶液、果聚糖酶溶液配制，加入硼氫化鈉步驟可參考GB 5009.255-2016[11]。

1.2.1 單糖檢測色譜條件及標曲繪制

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：CarboPaCTMPA1 250 mm×2 mm，淋洗液：A：水；B：氫氧化鈉溶液（100 mmol/L）；C：氫氧化鈉（150 mmol/L）乙酸鈉（500 mmol/L）混合溶液，梯度洗脫條件見表1，進樣量：20 μL，柱溫：30 ℃，檢測波形參見表2。標準溶液配制：用4個容量瓶分別準確稱取10 mg山梨醇、10 mg甘露醇、10 mg葡萄糖和10 mg果糖，用水稀釋定容至刻度，得1000 μg/mL山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖標準溶液。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Program of gradient elution

表2 檢測波形Table 2 Detection waves

1.2.1.2 標曲繪制 分別精密移取山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖標準溶液各1 mL至同一20 mL量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，制成山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖濃度均為20 μg/mL的混合儲備液。分別精密移取該儲備液0.04、0.1、0.2、0.4、0.5、1 mL至10 mL量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，制成系列混合標準使用液，即山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖濃度均為0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 μg/mL。將標準系列工作液分別注入離子色譜儀中，得到各濃度標準工作液色譜圖，測定相應的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 水解底物篩選

1.2.2.1 蔗糖與菊粉的純度考察 蔗糖溶液：準確移取1.0 mol/L蔗糖溶液（pH6.5的馬來酸鈉緩沖液為溶劑）0.8 mL于10 mL刻度試管中，以去離子水稀釋至刻度，搖勻，試液稀釋50倍后待測。菊粉溶液：準確移取1.0 mol/L菊粉溶液（pH6.5的馬來酸鈉緩沖液為溶劑）0.8 mL于10 mL刻度試管中，以去離子水稀釋至刻度，搖勻，試液稀釋50倍后待測。

1.2.2.2 果聚糖酶酶解蔗糖考察 準確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準確加入果聚糖酶（用pH4.5的乙酸鈉緩沖液稀釋至1～10 U/mL，下同）0.1 mL，（55±1）℃恒溫水浴保溫30 min，立即沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應。用水稀釋至刻度，混勻。試液稀釋50倍后待測。

1.2.3 糖醇轉化條件考察 在含有0.5 mg葡萄糖和0.5 mg果糖的混合溶液中加入一定量的10 mg/mL硼氫化鈉溶液（100、200、300、400、500 μL），旋渦振蕩混勻，置于一定溫度下（20、30、40、60 ℃）的恒溫水浴搖床中，150 r/min振搖一定時間（5、10、30、60 min）后，取出，冷卻至室溫，加入3 mL 200 mmol/L乙酸溶液，靜置10 min后搖勻，待測。當考察還原劑使用量時，固定還原溫度為40 ℃，還原時間為30 min；當考察還原時間時，固定還原劑使用量為300 μL、還原溫度為40 ℃；當考察還原溫度時，固定還原劑使用量為300 μL，還原為30 min。

1.2.4 離子色譜法測定蔗糖酶和果聚糖酶活力

1.2.4.1 酶解溶液制備 蔗糖酶的酶解：準確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準確加入蔗糖酶（用pH6.5的馬來酸鈉緩沖液稀釋至約4.5 U/mL，下同）0.1 mL，在（37±1）℃恒溫水浴中保溫30 min后，立即沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應。

葡萄糖和果糖的轉化：取出冷卻至室溫后的蔗糖酶酶解溶液加入1.2 mL硼氫化鈉溶液（10 mg/mL，下同），旋渦振蕩混勻，置于（60±1）℃恒溫水浴搖床中，150 r/min振搖30 min后，取出，冷卻至室溫，加入3 mL 200 mmol/L乙酸溶液，靜置10 min后加1 mol/L入氫氧化鈉溶液0.25 mL，搖勻。

果聚糖酶的酶解：繼續在上述溶液中準確加入果聚糖酶0.1 mL，（55±1）℃恒溫水浴保溫30 min，立即沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應。用水稀釋至刻度，混勻。試液稀釋50倍后待測。

1.2.4.2 試樣溶液的測定 將試樣溶液注入離子色譜儀中，得到試樣溶液的峰面積，根據標準曲線得到待測液中山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖的濃度（μg/mL），通過酶活力計算公式得蔗糖酶和果聚糖酶活力。蔗糖酶活力表示為：在37 ℃、pH6.5條件下，以蔗糖為底物每分鐘水解產生1 μmol還原糖相應的醇（山梨醇和甘露醇）所需的酶量（活性）定義為1個酶活力單位。果聚糖酶活力表示為：在55 ℃、pH4.5條件下，以蔗糖為底物每分鐘水解產生1 μmol還原糖（葡萄糖和果糖）所需的酶量（活性）定義為1個酶活力單位。

蔗糖酶活力計算：根據步驟所得山梨醇濃度、甘露醇濃度，用下述公式計算，得到蔗糖酶活力，蔗糖酶活力計算公式：

式中：X1，蔗糖酶活力，U/mL；C1，試樣中山梨醇的濃度，μg/mL；C2，試樣中甘露醇的濃度，μg/mL；V，試樣的最終定容體積，mL；M1，山梨醇的摩爾質量，182 g/mol；M2，甘露醇的摩爾質量，182 g/mol；Vx1，制備試樣時蔗糖酶溶液取用體積，mL；t1，制備試樣時蔗糖酶酶解蔗糖的時間，min。

果聚糖酶活力計算：根據所得葡萄糖濃度、果糖濃度，用下述公式計算，得到果聚糖酶活力，果聚糖酶活力計算公式：

式中：X2，果聚糖酶活力，U/mL；C3，試樣中葡萄糖的濃度，μg/mL；C4，試樣中果糖的濃度，μg/mL；V，試樣的最終定容體積，mL；M3，葡萄糖的摩爾質量，180 g/mol；M4，果糖的摩爾質量，180 g/mol；Vx2，制備試樣時果聚糖酶溶液取用體積，mL；t2，制備試樣時果聚糖酶酶解蔗糖的時間，min。

1.2.5 DNS法測定蔗糖酶和果聚糖酶活力 為了驗證本試驗測定蔗糖酶和果聚糖酶活力的可靠性，將本方法測定的結果與DNS法測定的結果進行比較，DNS方法參考GB 5009.255-2016中蔗糖酶和果聚糖酶活力的測定方法。過程如下：

標準曲線繪制：在葡萄糖系列濃度的比色管中分別加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，混勻后于沸水浴中加熱10 min。取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，用水定容至10 mL，混勻，以未加入葡萄糖的比色管為空白，用分光光度計測定波長540 nm處的吸光值。以吸光值為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.5.1 蔗糖酶活性測定 準確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準確加入蔗糖酶0.1 mL，在（37±1）℃恒溫水浴保溫30 min后，沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應，取出，冷卻至室溫后，再向該溶液中加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液后同1.2.5標準曲線繪制操作，混勻后稀釋5倍測定，由標準曲線計算待測酶測定液中和試劑空白測定液中葡萄糖的質量濃度。在相同的條件下，以沸水浴鈍化酶液作為試劑空白。根據1.2.4.2蔗糖酶活力計算公式計算蔗糖酶活力。

1.2.5.2 果聚糖酶活性測定 準確移取1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL于10 mL刻度試管中，準確加入果聚糖酶0.1 mL，在（55±1）℃恒溫水浴保溫30 min后，沸水浴中加熱3 min，以終止酶促反應，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加入0.5 mL，3,5-二硝基水楊酸溶液后同1.2.5標準曲線繪制操作，混勻后稀釋5倍測定。由標準曲線計算待測酶測定液中和試劑空白測定液中葡萄糖的質量濃度。在相同的條件下，以沸水浴鈍化酶液作為試劑空白。根據1.2.4.2果聚糖酶活力計算公式計算果聚糖酶活力。

1.3 數據處理

本文采用Chromeleon Client Program（6.80）色譜工作站進行數據采集，結果重復性平行測定5次，采用Microsoft Office Excel 2007進行結果計算，計算后的結果利用SPSS 23.0統計軟件對本試驗方法與DNS方法測定的酶活力結果進行方差分析，置信區間百分比為95%，色譜圖為直接截取色譜工作處理的的圖譜。

2 結果與分析

2.1 色譜條件確定及標準曲線繪制

目前關于應用離子色譜測定糖醇的文獻報道很多，de Souza等[21]建立了一種同時檢測葡萄酒樣品中的糖、有機酸和糖醇的方法，彭麗詩等[22]建立了一種離子色譜-脈沖安培法同時測定食品中9種糖和糖醇的方法，張水鋒等[23]也建立了一種離子色譜-脈沖安培法分析嬰幼兒配方乳粉中的糖和糖醇的方法。本試驗色譜條件為CarboPaCTMPA1 250 mm×2 mm，40% 100 mmol/L氫氧化鈉。在該色譜條件下，山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖能夠很好地分離，且色譜峰型也好，4種化合物的線性相關性良好，能夠滿足分析要求，具體結果見表3和圖1。

圖1 四種化合物色譜分離圖Fig.1 Chromatograms of mannitol, sorbitol, glucose and fructose

表3 山梨醇、甘露醇、葡萄糖和果糖四種化合物的線性及范圍Table 3 Linearity and range of annitol, sorbitol,glucose and fructose

2.2 水解底物的篩選

通常，蔗糖酶活力測定采用的底物為蔗糖，果聚糖酶活力測定采用的底物為菊粉，但菊粉很容易水解且高純度的菊粉很難獲得[24-25]。圖2為一定量的蔗糖和菊粉分別進樣得到的色譜圖，可見蔗糖色譜峰中不含葡萄糖和果糖，而菊粉中含有一定量的葡萄糖和蔗糖，即采用此菊粉為底物測得的果聚糖酶活力將偏高。林晨[18]、常曉川[26]、王東方[27]等多篇文獻都報道過果聚糖酶可酶解蔗糖。圖3是采用蔗糖為底物，經果聚糖酶水解后的圖譜，可見圖譜中出現了蔗糖和果糖的峰，即證明了果聚糖酶能夠水解蔗糖為葡萄糖和果糖，即采用蔗糖底物也能夠測定出果聚糖酶的活力。因此本試驗可采用同一底物蔗糖以同時測定蔗糖酶和果聚糖酶的活力。

圖2 菊粉和蔗糖色譜峰Fig.2 Chromatograms of inulin and sucrose

圖3 果聚糖酶酶解蔗糖的色譜圖Fig.3 Chromatograms of sucrose enzymatic hydrolysised by inulinase

2.3 糖醇轉化

通過上述水解底物篩選的討論可發現，蔗糖酶和果聚糖酶的活力均可通過測定酶解蔗糖后的產物（葡萄糖和果糖）進行測定，若能在一次進樣后同時將蔗糖酶和果聚糖酶的活力進行測定，將能大大節約時間。而兩種酶的酶解產物均是葡萄糖和果糖，如何分別表達兩種酶的活性是試驗的關鍵。在進一步試驗過程發現葡萄糖和果糖是還原性糖，能夠在適宜條件下被還原成相應的醇。Tathod等[28]建立了一種利用雙金屬為催化劑將農業廢棄物（C5糖、C6糖、半纖維素、菊粉和農業廢棄物）轉化為糖醇的方法。章青等[29]公開了一種通過采用硼氫化鹽為還原劑, 將葡萄糖還原制備得到山梨醇的方法；竇光朋等[30]公開了一種利用鉬酸鹽為催化劑，使果糖和葡萄糖在加氫作用下向甘露醇和山梨醇的轉化，實現低聚果糖廢液生產出甘露醇和山梨醇的方法。可見，蔗糖酶酶解并將蔗糖酶鈍化后的產物葡萄糖和果糖可以被還原劑還原為甘露醇和山梨醇，在此條件下再進行果聚糖酶酶解蔗糖反應得到其產物葡萄糖和果糖，產物便不會相互干擾。試驗即可分別用甘露醇和山梨醇表達蔗糖酶的活力，用葡萄糖和果糖表達果聚糖酶的活力。這便是本實驗的原理關鍵所在，見圖4。

圖4 實驗過程原理圖Fig.4 Principle diagram of experimental process

本試驗能否在一次進樣后同時、準確測定出兩種酶活力，取決于蔗糖酶解的產物葡萄糖和果糖能否完全轉化為山梨醇和甘露醇，因此本試驗對還原劑硼氫化鈉的用量、作用時間及作用溫度進行了考察。

試驗以1 mg還原糖（0.5 mg葡萄糖、0.5 mg果糖）為本底，并以轉化率（山梨醇和甘露醇的總量與葡萄糖和果糖總量的百分比值，約接近100%，轉化越徹底）為指標，同時以色譜圖佐證，確定還原劑硼氫化鈉的用量、作用時間和作用溫度。為考察還原劑硼氫化鈉的用量，控制作用時間為30 min、溫度為40 ℃，從表4可看出，隨著硼氫化鈉用量的增加，轉化率升高，當硼氫化鈉用量達到400 μL時已足以使葡萄糖和果糖完全還原為山梨醇和甘露醇，即轉化率已經達到100%，即0.5 mg葡萄糖和0.5 mg果糖已經全部轉化為葡萄糖和果糖；為考察還原劑硼氫化鈉的作用時間，控制用量為300 μL、作用溫度為40 ℃。從表5可以看出作用時間在30 min時轉化率已達到97%，60 min轉化率為98%，

表4 還原劑用量對轉化率的影響Table 4 Effect of reductant dosage on conversion rate

表5 還原時間對轉化率的影響Table 5 Effect of reduction time on conversion rate

兩者差異不大，因此選擇還原時間為30 min；為考察溫度對糖醇轉化的影響，控制還原劑硼氫化鈉用量為300 μL、作用時間為30 min。從表6可以看出，隨著溫度的升高，轉化率也明顯升高，在溫度升至60 ℃時，轉化率達到94%，可以滿足實驗需求。

表6 還原溫度對轉化率的影響Table 6 Effect of reduction temperature on conversion rate

綜上，還原劑硼氫化鈉的用量、作用時間、作用溫度分別確定為400 μL、30 min、60 ℃，在此條件下，如圖5所示，葡萄糖和果糖色譜峰已消失，完全轉化為山梨醇和甘露醇的色譜峰。在實際應用過程中，還原劑硼氫化鈉的用量應與樣品本底還原糖量成正相關，經考察試驗條件下1.0 mol/L蔗糖溶液0.8 mL，使用蔗糖酶后的水解產物約有還原糖3 mg，因此將還原劑硼氫化鈉的用量確定1.2 mL。該試驗在還原劑硼氫化鈉用量為1.2 mL、作用時間為30 min，溫度為60 ℃條件下，可將本試驗中蔗糖酶酶解產物果糖和葡萄糖完全轉化為山梨醇和甘露醇，見圖6。

圖5 葡萄糖和果糖完全轉化為山梨醇和甘露醇的色譜圖Fig.5 Chromatogram of complete conversion of glucose and fructose to sorbitol and mannitol

圖6 實驗條件下的葡萄糖和果糖完全轉化為山梨醇和甘露醇的對比圖Fig.6 Comparative chromatograms of complete conversion of glucose and fructose to sorbitol and mannitol under experimental conditions

2.4 方法對比

為驗證本方法測定蔗糖酶和果聚糖酶活力的可靠性，將本試驗方法測定的結果與3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測定結果進行比較。根據DNS法測定酶活力的原理，酶解后的產物為葡萄糖和果糖，兩者均為還原糖，因此均能與3,5-二硝基水楊酸發生反應生成棕紅色氨基化合物，因此傳統的DNS法測得的量實際上是還原糖的總量。因此為了便于比較，本方法用水解產物的總量來度量蔗糖酶、果聚糖酶活力的大小。本方法與DNS法測定的蔗糖酶和果聚糖酶活力比較見表7。利用SPSS軟件對兩種方法的結果進行統計分析，分析結果見表8。在95%置信區間百分比下，得到蔗糖酶兩種方法測定的統計結果。萊文方差等同性檢驗顯示，P=0.121＞0.05，即方差齊性檢驗結果為兩組方差齊性，因此兩組比較平均值等同性t檢驗結果下的P=0.291＞0.05兩種方法測定結果無統計學差異。同理得到果聚糖酶的統計結果見表9。其萊文方差等同性檢驗顯示，P=0.058＞0.05，即方差齊性檢驗結果為兩組方差齊性，因此兩組比較平均值等同性t檢驗結果下的P=0.433＞0.05，果聚糖酶的兩種方法測定結果亦無統計學差異。且本方法的5次測定的蔗糖酶活力、果聚糖酶活力RSD分別為2.0%、1.7%，說明本方法精密度良好，綜上所述說明離子色譜-脈沖安培法同時測定蔗糖酶和果聚糖酶的活性是可行可靠的。

表7 離子色譜法與3,5-二硝基水楊酸比色法測定的酶活力比較Table 7 Comparison of enzyme activity determined between ion chromatography-pulsed amperometric detector method and DNS method

表8 兩種方法蔗糖酶活性結果統計分析Table 8 Statistical analysis of sucrase activity by two methods

表9 兩種方法果聚糖酶活性結果統計分析Table 9 Statistical analysis of inulinase activity by two methods

3 結論

本試驗在選擇如硼氫化鈉、乙酸等為環境友好型試劑的前提下采用CarboPaCTMPA1 250mm×2 m的色譜柱，40%，100 mmol/L氫氧化鈉等度洗脫的色譜條件對甘露醇、山梨醇、葡萄糖和果糖進行分析測定，能滿足四種化合物測定的要求；驗證并證明了果糖酶能夠水解蔗糖為葡萄糖和果糖，果聚糖酶活力的測定可以采用蔗糖為底物；硼氫化鈉用量為1.2 mL，作用時間30 min、作用溫度60 ℃，可以將本實驗中的蔗糖酶解產物葡萄糖和果糖完全轉化為山梨醇和甘露醇；最后將本方法與DNS法進行比較，兩種方法測定的蔗糖酶活力、果聚糖酶活力均無顯著性差異（P＞0.05）；且本方法測定的蔗糖酶活力、果聚糖酶活力RSD分別為2.0%、1.7%，精密度好，即本試驗建立的離子色譜-脈沖安培法同時測定蔗糖酶和果聚糖酶的活力方法是可行的。據本試驗原理，蔗糖酶和果聚糖酶的加入順序是可以交換，且可以只測定其中一種酶的活力，即當某種酶酶解產物可以通過離子色譜法進行檢測時，其酶活力是能通過離子色譜法進行測定的。