風味酵母A10-2的高密度培養及其生長動力學

朱婭媛，王曉謙，苗春雷，李巧連，朱新貴,2,

（1.李錦記（新會）食品有限公司，廣東江門 529100；2.華南農業大學，廣東廣州 510642）

調味品是現代生活的必需品。研究表明發酵類調味品在釀造過程中產生的風味物質已知有300余種[1-2]，其風味的形成是多菌種相互作用的結果，如米曲霉、乳酸菌及酵母菌等。其中酵母菌在發酵過程中主要產生的酯類、醇類等物質，對醬料風味的形成具有十分重要的貢獻[3]。在發酵特定階段接種選育的耐鹽產香酵母，使其在發酵過程中合成及積累特征性風味物質，如苯乙醇、呋喃酮、4-乙基愈創木酚等，可合理改善及優化醬料風味協調性及提升最終感官指標[4-5]。近年來，充分發揮酵母菌在醬醪中的生香作用，是國內外醬料生產企業所重點關注的研究內容[6]，而目前對人為篩選獲得可應用于醬料的風味酵母的高密度培養工藝及生長動力學的研究較少，對其高密度批量培養工藝的研究及實現是其可應用化的前提。

高密度培養指微生物在液體培養中細胞群體密度超過常規培養10倍以上時的生長狀態的培養技術[7]。流加補料工藝在高密度培養技術廣泛應用：通過流加工藝進行培養基限制性底物的不間斷補充，如碳、氮源，確保菌體維持高速生長、繁殖，而最終得到高濃度菌體的培養液，有效節省培養容器體積及培養基的消耗，降低生產周期及成本[8]。因此，研究風味酵母的高密度培養工藝及優化是具有實踐意義的。生長動力學將培養過程中菌體繁殖、基質消耗、產物生成有關的因素用一定形式的數學模型進行表達和定量描述[9-11]。在醬料風味調控技術中，醬醪中產香酵母的篩選、馴化及繁殖應用是非常關鍵的環節，建立目標酵母的生長動力學模型，將為風味酵母的高密度產業化培養提供理論及實踐指導基礎[12]。，

本文通過對醬醪中篩選的風味酵母A10-2的高密度流加分批補料工藝進行研究，對培養基質氮源、碳源優化，生長動力學、基質消耗動力學進行參數探索及模型構建，分析其生長及基質消耗的動態平衡形成條件以及內在規律，以獲得培養的最大菌體干重濃度以及最短培養時間。同時，根據生長動力學模型對目標酵母培養條件進行分析，評價所建生長動力學預測模型的有效性，為設計合理的風味酵母高密度流加補料培養工藝及酵母生長指標的預測提供理論指導依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 由李錦記（新會）食品有限公司醬油醪篩選所得，經分析為高產4-乙基愈創木酚的風味酵母，初步鑒定為Wickerhamiella versatilis，命名為A10-2[13]；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、NH4H2PO4、（NH4）2HPO4、CH4N2O、NH4Cl等 均為國產分析純；維生素B1、維生素B5、維生素B6、生物素 均為阿拉丁純品；糖蜜 廣西陸屋歐亞糖業有限公司。

30 L自吸式發酵罐 南京天匯生物技術裝備有限公司；BlueStar B紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；H2050R離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；MS3002TS/02電子秤 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；794自動點位滴定儀 瑞士萬通公司；ZWY-211C搖床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基制備 種子液培養基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L。

發酵培養基配方：維生素B120 mg/L, 維生素B620 mg/L，維生素B520 mg/L，生物素10 mg/L，MgSO4·7H2O 30 mg/L，KH2PO40.1 g/L。酸化糖蜜作為培養基碳源根據其總糖含量添加，控制培養液總糖濃度為10 g/L。

pH調節劑：10% H2SO4，10% Na2CO3。

流加補料液配方：碳源為酸化糖蜜（50°Brix；硫酸調節pH至4.3，4 h后調整pH至5.3），氮源按單因素實驗優選氮源配成，磷源為10% KH2PO4。

單因素實驗篩選培養基：在發酵培養基配方基礎上去除碳源與氮源，加入所需篩選因素配成。

1.2.2 種子液培養 取新鮮斜面菌種接種至滅菌（121 ℃，15 min）后裝有100 mL種子液培養基的250 mL搖瓶中，在30 ℃、180 r/min條件下搖床培養24 h。

1.2.3 氮源單因素實驗設計 使用發酵培養基，添加酸化糖蜜至培養液中總糖濃度為20 g/L。分別使用磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、尿素、氯化銨作為氮源變量，配制不同濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/100 mL）培養基各100 mL于250 mL三角瓶中，分別接種斜面新鮮菌種，于30 ℃、180 r/min條件下搖床培養，48 h后測定OD600nm值。

1.2.4 發酵罐補料流加高密度培養 將20 L發酵培養基加入發酵罐（最大裝液量30 L），實消后取液體菌種按10%接種量接種至發酵培養基中，使用自吸式發酵罐進行酵母高密度培養，培養過程控制溶氧大于30%，pH4.8～5.3，溫度（30±0.3） ℃。每2 h測定菌體干重濃度，對數期增長后菌體干重濃度不再升高定義為培養終止狀態。酸化糖蜜作為碳源，選擇單因素實驗優選氮源進行流加補料，根據《酵母生產與應用手冊》，流加糖液速度符合函數關系式[14]：

式中：V0表示初始培養液體積，L；X0表示初始菌體干重濃度，g/L；μ表示設定比生長速度（根據定期菌體干重濃度變化進行計算及調整），h-1；Yx/s表示菌體對基質（總糖）得率，g菌體干重/g基質；F表示濃基質（糖液）的流加速度，L/h； SF表示濃基質濃度，g/L；S表示培養液中基質濃度，g/L；t表示培養時間，h。

1.2.5 高密度培養過程流加工藝碳源最適濃度的研究

多批次補料流加培養菌體，調整碳源（酸化糖蜜）泵入流速，通過持續流加糖液保持培養液總糖濃度不同批次分別為0～0.2、0.2～0.4、0.4～0.6、0.6～0.8、0.8～1.0、1.0～1.2、1.2～1.4 g/100 mL，根據培養終酵母干重濃度與培養時間，對比不同批次發酵培養液中不同碳源（總糖）濃度對菌體干重平均生長速度的影響。

1.2.6 高密度培養菌體生長動力學模型建立 流加補料高密度培養，培養過程中每2 h進行取樣，檢測菌體干重。根據菌體生長情況，以進入對數生長時期的時間為起點，取樣時間縮短為每0.5 h，同時檢測總糖含量、菌體干重，計算進入對數生長時期后單位體積菌體生長所需的總糖耗用量。通過研究高密度培養過程中菌種干重與時間及基質（總糖）消耗的對應關系，建立生長動力學、基質消耗動力學模型。

1.2.6.1 菌體生長動力學模型的建立 Logistic 方程是用來描述培養過程中菌體生長隨時間變化規律最常用的模型，是典型的“S”形曲線，選擇使用Logistic方程建立酵母A10-2的生長動力學，菌體生長模型的微積分表達式如公式（2）所示[15]：

對式（2）進行積分后得到：

式中：X0表示菌體初始濃度，g/L；X表示菌種濃度，g/L；Xm表示菌種濃度，g/L；μm表示最大比生長速率，h-1；t表示發酵時間，h。

1.2.6.2 菌體底物消耗動力學模型的建立 由物料恒算可知，限制性底物的消耗用于菌體生長、菌體維持和產物合成這3 個方面[16]。對于限制性底物的消耗一般采用類似Luedeking-Piret方程[17-18]來描述：

由于培養過程中盡可能地抑制菌體代謝，其代謝產物所耗用的基質則微乎其微。忽略菌體代謝產物所耗用的碳源后：

比底物消耗速率方程為：

將式（5）微積分后得：

式中：X表示菌體干質量濃度，g·L-1；P表示產物濃度，g·L-1；Yx/s表示菌體對基質（總糖）得率，g菌體干質量/g基質；Yp/s表示產物對基質得率，g產物/g基質；ms表示維持系數，g·L-1·h-1；qs=dS/Xdt，底物比消耗速率，g·g-1·h-1； μ=dX/Xdt比生長速率，h-1；t表示培養時間，h。

1.2.7 分析檢測 菌體干重測定：準確量取100 mL培養液，離心10 min（4000 r/min），棄上清液。加100 mL蒸餾水洗滌，再次離心10 min，棄上清液后以蒸餾水將菌種打散洗出至培養皿，置于烘箱中105 ℃至恒重后進行測定[19]。

總糖測定：采用酸水解法，使用3，5-二硝基水楊酸進行測定[20]。

1.3 數據處理

采用Excel 2019軟件對3次重復數據進行統計分析并作圖，取平均值作為擬合數據。使用SAAinc-Elisa軟件對數據進行擬合。

2 結果與分析

2.1 碳、氮源優選實驗

2.1.1 氮源優選單因素實驗 糖蜜中含有少量氮源，甘蔗糖蜜中總氮含量約為0.6%（質量比），其中大部分以生物堿及胺態氮形式存在[21-22]。流加補料高密度培養工藝中，糖蜜所帶入培養液的總氮不足0.1 g/L，遠不足以支持酵母的增殖。為解決氮源缺乏而導致的增長遲緩問題，需通過外加氮源進行補充。菌體對有機氮源的利用優于無機氮源，但批量生產中，使用無機氮源更符合對成本的控制需求[23]。

圖2 不同濃度磷酸二氫銨（氮源）對培養終酵母濃度的影響Fig.2 Effects of different concentration of NH4H2PO4 as nitrogen on the maximum density of yeast

圖3 不同濃度磷酸氫二銨（氮源）對培養終酵母濃度的影響Fig.3 Effects of different concentration of （NH4）2HPO4 as nitrogen on the maximum density of yeast

使用搖瓶法進行氮源優選實驗，因單次培養基投入搖瓶培養而收獲菌體濃度小，為避免低濃度時檢測菌體干重的誤差，使用OD600nm檢測值作為干重濃度的反饋。根據檢測數據及統計分析，在不同氮源條件下，如圖1～圖4所示，氮源濃度在0.05～0.2 g/100 mL時，各實驗組均呈現了菌體吸光度隨氮源濃度增加而增大的趨勢；在氮源濃度大于0.2 g/100 mL時，菌體吸光度隨氮源濃度增加而減少。結果表明，氮源濃度在0.05～0.3 g/100 mL范圍內，尿素與磷酸氫二銨對酵母菌體培養效果無顯著差異（P＞0.05），磷酸二氫銨作為氮源的培養效果最佳，氯化銨作為氮源時培養效果較差。在氮源濃度0.2 g/100 mL情況下，磷酸二氫銨作為氮源得到吸光度最大（P＜0.05），即反饋菌體干重濃度最大。

圖1 不同濃度尿素（氮源）對培養終酵母濃度的影響Fig.1 Effects of different concentration of CH4N2O as nitrogen on the maximum density of yeast

圖4 不同濃度氯化銨（氮源）對培養終酵母濃度的影響Fig.4 Effects of different concentration of NH4Cl as nitrogen on the maximum density of yeast

2.1.2 高密度培養過程流加工藝碳源最適濃度的研究 糖蜜中含有大量的蔗糖和轉化糖，根據研究，甘蔗糖蜜中總糖占比約50% （糖蜜固形物80°Brix～85°Brix），其中非發酵性糖僅占總糖含量的10%左右[24]。除碳源、氮源外，糖蜜中還含有鉀、鈣、磷、硫及維生素等微量元素，亦能促進酵母菌體的增長[25]。使用糖蜜作為高密度培養過程的唯一碳源，是滿足菌體所需且成本低廉、培養效果較好的原料。影響高密度培養的因素有很多，如溫度、pH、菌體活性等，而基質濃度則是流加補料高密度培養工藝影響酵母干重得率的關鍵因素之一[26-27]。

流加補料過程中，通過調整碳源泵入速度以維持培養液中總糖濃度在設定范圍內。根據實驗結果，培養液總糖濃度不同，則酵母增長的平均生長速度（培養終狀態酵母干重濃度/培養總耗時）也有較大差異。如圖5所示，當培養過程中培養液總糖濃度始終維持在0～0.6 g/100 mL時，酵母干重平均增長速度隨總糖濃度增大而增大。當總糖濃度超過0.6 g/100 mL，酵母干重平均增長速度隨總糖濃度增加而減小。在培養液總糖濃度控制在0.4～0.6 g/100 mL時，其干重平均增長速度達到最大。酵母的生長與代謝取決于很多因素，如氧、基質、生長周期等。根據研究，酵母具有“Crabtree效應”（又稱“葡萄糖效應”），當培養液含糖量過高時，即使在氧充足的情況下，酵母也會進行酒精發酵而減少糖的利用率，致使自身細胞增長速度降低[28-29]。而根據實驗結果，在培養液總糖濃度大于0.6 g/100 mL時，單位體積酵母的干重增長速度顯著降低亦印證了此效應。

圖5 培養液不同總糖濃度對菌體干重的影響Fig.5 Effects of different concentrations of total sugar in culture medium on yeast cell dry weight

2.2 菌體動力學模型建立

2.2.1 菌體生長動力學模型建立 現代微生物動力學理論起源于Monod方程，作為描述菌體生長的模型，被認為更適合菌體生長較慢、密度較低且無抑制作用的環境，反饋了菌體增長與基質消耗的μ=μ（S）情況[30]。嘗試使用Monod模型對A10-2酵母培養階段各數據進行擬合，以1/S為橫坐標，1/μ為縱坐標作圖，所得結果擬合決定系數并不高（R2=0.807）。Monod模型在補料流加高密度培養工藝中，無法描述菌體密度對自身的抑制，且流加基質的補充亦降低了基質對菌體的限制性影響，擬合系數相對較低亦佐證了此理論。Logistic方程能夠很好的詮釋分批發酵過程中菌體濃度增加對自身的抑制而呈現S形生長曲線[31]。因此，選擇使用Logistic方程更適用于描述產香酵母的生長。

如圖6所示，使用酵母高密度培養過程中干重與時間數據作圖，根據Logistic模型進行數據分析，并運用SAAinc-Elisa軟件對實驗值進行非線性擬合，得到擬合公式中μm值為0.4764 h-1。將動力學參數X0=1.73 g/L、Xm=36.09 g/L、μm=0.4764 h-1代入式（3）中，可得到菌體生長動力學方程：

圖6 酵母生長動力學模型擬合曲線Fig.6 Fitting curve of yeast growth kinetic model

擬合決定系數R2=0.9721，驗證了Logistic方程能夠很好地描述產香酵母A10-2分批高密度培養過程中菌體的生長情況。

在高密度培養過程中，流加補料使培養液總體積增大。但由于A10-2酵母的遲緩期時間較長（約20 h），而對數期時間較短（8～10 h），補料流加時濃糖液產生的稀釋率對發酵液整體體積的影響較小（耗用糖液體積:培養液終體積=1:8.5）。由此認為取樣間隔時間為2 h或更短的情況下，可忽略流加造成的體積變化，此動力學方程對實際生產是具有預測指導意義的。

2.2.2 菌體底物消耗模型建立選用類似Luedeking-Piret方程建立菌體總糖消耗模型，如圖7所示，根據式（5）比底物消耗速率方程將μ對比底物消耗速率qs作圖，并進行線性回歸：

圖7 比生長速率μ與底物比消耗速率qs的關系Fig.7 Relationship curve of μ versus qs

得到擬合方程中Yx/s最大值YG=0.5879 g/g，ms=0.0127 g·L-1·h-1。將YG、ms及生長動力學所得X方程代入式（6）得：

對于流加補料高密度培養工藝，溶液中糖液的持續補充使公式中的S0無法賦予定值計算，而單位體積內總糖的累加消耗量可通過上式變形得到：

該方程描述了高密度培養過程中單位體積培養液中總糖的累加消耗情況，相關系數R2=0.9767說明了模型擬合度高，方程建立較理想。

2.2.3 模型驗證 為檢測模型的誤差及驗證模型的準確性，重復實驗并測定、計算菌體干重數據及單位體積總糖累加消耗數據，使用實驗實際值與擬合公式計算值進行對比，計算絕對誤差（表1）。

表1 A10-2酵母高密度培養動力學數據擬合值與實驗值對比Table 1 Comparison of growth kinetics of A10-2 yeast between calculated and experimental data

由于菌體適應期（0～22 h）生長緩慢且生物量受接種初期影響較大，為排除操作性影響而取菌種進入對數期后數據進行研究。數據表明，菌體干重與單位體積總糖耗用量實驗數據與擬合計算數據的絕對誤差均小于10%，認為所建立菌體生長動力學模型與底物（總糖）消耗模型可較好地描述A10-2酵母高密度流加補料工藝的生長與總糖利用情況[32]，模型準確性較高，能夠為實際培養過程提供理論參考。

3 結論

本文對可應用于醬料增香的風味酵母進行高密度培養補料碳、氮源的優化，以成本控制為前提有效獲得了最佳補料方案：磷酸二氫銨作為氮源，0.2 g/100 mL為優選濃度；糖蜜作為碳源流加補充，培養基中總糖流加保持0.4～0.6 g/100 mL濃度可獲得較高的培養終菌體干重收獲率。另外，本文也探索了高密度培養過程風味酵母的生長動力學及基質消耗動力學，對其模型的建立將為培養的預測性及可控性提供理論指導依據。

后續研究將圍繞放大生產批量高密度培養工藝進行參數差異的探究及準確性調整，從而建立以高菌體干重收獲率為目的的風味酵母A10-2高密度補料流加工藝，并根據動力學模型對其進行預測及培養控制。風味酵母高密度批量生產的實現及調控，將對其在醬料中的有效應用及風味強化技術起到輔助性推動作用。