槲皮素對草莓生長發育、光合和生理生化特性影響的綜合評價

柳苗苗， 蔡偉建， 張斌斌， 趙密珍， 王 靜， 劉懷鋒

(1.石河子大學農學院，新疆石河子 832000； 2.江蘇省農業科學院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014)

草莓生長周期短、產出快、收益高，是江蘇等地冬春季第1果。草莓以設施生產為主，冬春季低溫弱光會嚴重制約草莓生產，提高設施條件下草莓的光合速率和抗性，是冬春季草莓生產的重要研究方向。

槲皮素(quercetin)即3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮，是一種植物性黃酮醇，屬于多酚中的黃酮類化合物，廣泛存在于果蔬、中草藥植物的花、葉和果實中[1]，位于葉綠體外被，有強抗氧化作用[2-3]，有望成為一種新的植物生物刺激素[2-4]。槲皮素在植物中的應用較少，主要集中在保護植物免受非生物脅迫的影響[5-7]，或通過激素信號[脫落酸(ABA)、吲哚-3-乙酸(IAA)]級聯調控影響植物生長發育[8-9]。

本試驗以寧玉草莓品種為材料，研究不同濃度(0、20、40、80 mg/L)槲皮素溶液對草莓生長發育、光合及抗性的影響，以期確定槲皮素對于草莓耐低溫弱光的作用，為未來草莓的生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與試劑

供試材料為寧玉草莓(由江蘇省農業科學院選育并經江蘇省農作物品種審定委員會鑒定)，將草莓種苗定植于江蘇省農業科學院溧水植物科學基地中長度55 m、跨度7 m的塑料大棚內，壟高 30 cm，壟面寬60 cm，壟間距40 cm，采用高壟雙行的栽培方式。處理分為6個小區，種苗植株長勢均一，分別噴施20、40、80 mg/L槲皮素(分別記作T1、T2、T3處理)，以噴清水為對照(CK)，每個小區設5株重復，取草莓頂端生長點以下完全展開的第2～3張葉片測定相關指標。

槲皮素、丙二醛(MDA)試劑盒、脯氨酸測定試劑盒、總抗氧化能力試劑盒(T-AOC)均購于南京建成生物工程研究所，測定可溶性糖含量所用試劑盒購于索萊寶生物科技有限公司，蛋白含量測定所用考馬斯亮藍法蛋白含量測試盒、測定植物總酚(TP)含量所用測試盒購于蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 植株農藝性狀測定 2021年2月測定草莓的農藝性狀和光合特性。株高、葉柄長、果長和果寬用卡尺測定，根莖粗用游標卡尺測定，花序數、葉片數用目測法測定，果質量用電子計數天平稱量，葉面積使用CI-203手持式激光葉面積儀(美國CID公司)測定，相對葉綠素含量使用SPAD-502 Plus便攜式葉綠素測定儀(日本柯尼卡美能達公司)測定。選擇連續無云的晴天，在09：00—11：00用Li-6800便捷式光合系統測定儀(美國LI-COR公司)測定光合參數[光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)]。

1.2.2 葉片生理生化指標測定 丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖、可溶性蛋白、總酚(TP)含量和總抗氧化能力(T-AOC)均用試劑盒檢測。

1.3 數據處理

用Excel 2016進行試驗數據整理，用SPSS 25.0進行單因素方差分析(ANOVA)、鄧肯差異顯著性(α=0.05)分析和雙變量相關性分析，用DPS 7.05統計處理軟件進行主成分分析。

通過如下公式得出不同處理后綜合指標的隸屬函數：

U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1，2，3，…，n。

式中：Xj表示第j個綜合指標；Xmax、Xmin分別表示第j個綜合指標的最大值、最小值。根據公式計算出每個處理所有指標的隸屬函數值。

權重計算公式：

式中：Wj表示在所有綜合指標中第j個綜合指標的重要程度(權重)；Pj表示第j個綜合指標的貢獻率。

綜合評價指標(D值)的計算公式：

D=n∑j=1[u(Xj)×Wj]，j=1，2，3，…，n。

式中：D值即草莓在不同濃度槲皮素處理下用綜合指標評價得到的最優處理濃度的綜合評價值。

用Origin 2019軟件分析作圖，數據均用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 對草莓花序數、結果數和果實質量的影響

由圖1可以看出，不同濃度槲皮素對草莓花序數量和結果數量的影響不大，噴施清水的對照與20、40、80 mg/L 3個濃度槲皮素處理的花序數量間差異不顯著，但結果數量有顯著差異。清水對照與20、40、80 mg/L槲皮素處理的花序數分別為2.86、3.36、2.73、3.07個，結果數分別為3.52、6.24、5.74、6.47個。由表1可以看出，與清水對照相比，3種濃度槲皮素處理的單果質量和果實總質量均增加，清水對照與20、40、80 mg/L槲皮素處理的果實總質量、單果質量分別為301.14、338.18、366.60、382.08 g和19.30、22.91、25.13、25.21 g，3種濃度槲皮素處理間的果實可溶性固形物含量差異不顯著。

2.2 對草莓植株農藝性狀的影響

由表2可以看出，在不同濃度槲皮素處理下，草莓農藝性狀中的株高、葉片數與清水對照處理相比均無顯著差異，清水對照與3個濃度槲皮素處理的株高分別為12.85、12.73、12.95、12.75 cm，相互之間無顯著差異；各處理的植株葉片數為11.85～15.67 張，沒有顯著差異。與清水對照相比，槲皮素處理的植株葉柄更長、葉面積更大、根莖越粗且差異顯著，20mg/L槲皮素處理的葉面積最大，為18.75 cm2，其次為40 mg/L槲皮素處理(18.19 cm2)和80 mg/L槲皮素處理(18.17 cm2)，葉面積最小的為清水對照(15.23 cm2)；40 mg/L槲皮素處理的葉柄最長，根莖最粗，在葉柄長度上，表現為40 mg/L槲皮素處理(11.33 cm)>20 mg/L槲皮素處理(11.10 cm)>80 mg/L 槲皮素處理(11.08 cm)>清水對照(8.99 cm)；在根莖粗上，表現為40 mg/L槲皮素處理(15.70 mm)>20 mg/L槲皮素處理(15.57 mm)>80 mg/L槲皮素處理(15.25 mm)>清水對照(12.32 mm)。

表1 不同濃度槲皮素對草莓果實質量的影響

表2 不同濃度槲皮素對草莓植株農藝性狀的影響

2.3 對草莓葉片葉綠素含量和光合作用的影響

由圖2可以看出，槲皮素處理顯著提高了草莓植株葉片的葉綠素含量，20、40、80 mg/L槲皮素處理的葉片葉綠素含量分別比對照高7.00%、6.86%、8.13%，在不同濃度槲皮素處理下，葉綠素含量無顯著差異。

由圖3可以看出，槲皮素處理提高了草莓葉片的凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導度。在40 mg/L槲皮素處理下，Pn最大，為 22.77 μmol/(m2·s)，顯著高于對照的 20.73 μmol/(m2·s)；在20、80 mg/L槲皮素處理下，Pn分別為21.52、22.33 μmol/(m2·s)，20 mg/L 處理、對照和40 mg/L槲皮素處理間有顯著差異。在80 mg/L槲皮素處理下，Tr最大，達 4.4 mmol/(m2·s)，顯著高于對照[3.3 mmol/(m2·s)]。在20、40 mg/L 槲皮素處理下，Tr分別為3.9、4.2 mmol/(m2·s)，20 mg/L處理、對照和80 mg/L槲皮素處理間差異顯著。80 mg/L 槲皮素處理的Ci、Gs分別為 283.17 μmol/mol、0.348 4 mol/(m2·s)，40 mg/L 槲皮素處理的Ci、Gs分別為 275.88 μmol/mol、0.34 mol/(m2·s)，對照Ci、Cs分別為 265.33 μmol/mol、0.28 mol/(m2·s)。

2.4 對草莓葉片丙二醛含量和脯氨酸含量的影響

由圖4-A可以看出，不同濃度槲皮素處理降低了草莓葉片中的丙二醛含量，并且隨著施用槲皮素濃度的遞增，丙二醛含量逐漸降低，其中清水處理的丙二醛含量最高，達0.0267 μmol/g，80 mg/L槲皮素處理的丙二醛含量僅為0.018 3 μmol/g，表明施用槲皮素可有效緩解逆境中植株細胞的受損。由圖 4-B 可以看出，施用槲皮素處理可有效提高植株葉片細胞中的脯氨酸含量，其中40、80 mg/L槲皮素處理下草莓植株葉片的脯氨酸含量分別為38.5、37.1 μg/g，與清水對照(20.5 μg/g)間差異顯著。

2.5 對草莓葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

由圖5可以看出，槲皮素處理的草莓植株葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白含量與清水對照相比差異顯著，施用槲皮素有效提高了草莓植株葉片中可溶性糖、可溶性蛋白含量。在3個不同濃度槲皮素處理下，可溶性糖含量逐漸增加，分別為16.83、21.16、22.33 mg/g(圖5-A)；但3個濃度槲皮素處理之間的草莓葉片可溶性蛋白含量差異不顯著(圖5-B)。

2.6 對草莓葉片總酚和總抗氧化能力的影響

施用不同濃度槲皮素對草莓葉片總酚含量(圖6-A)和總抗氧化能力(圖6-B)沒有顯著影響。清水對照(CK)與T1、T2、T3處理的總酚含量分別為16.18、16.74、16.78、16.76 mg/g，總抗氧化能力分別為8.392、8.785、9.558、8.864 U/mg。

2.7 各項指標相關性主成分分析及隸屬函數法綜合評價

由表3可以看出，總酚含量與葉柄長、葉片數，可溶性糖含量與果實總質量，根莖粗與葉柄長、可溶性蛋白含量間的相關系數最大，均為1.00。葉片數與葉柄長、葉面積、葉綠素含量、根莖粗、總酚含量及可溶性蛋白含量間呈極顯著正相關，相關系數均為0.96以上。呈極顯著正相關的還包括結果數與葉片數、葉面積、可溶性蛋白含量、總酚含量，以及根莖粗與葉面積、葉片數、葉綠素含量、總酚含量；單果質量與葉柄長、葉片數、結果數、果實縱徑、果實橫徑、果實硬度呈顯著正相關，相關系數分別為0.93、0.94、0.88、0.92、0.94、0.88，同時單果質量與果實總質量、可溶性糖含量、蒸騰速率、凈光合作用、氣孔導度均呈極顯著正相關。

在對不同濃度槲皮素處理結果的比較評價中，直接用以上各項指標不具有代表性，結果也缺乏準確性，可利用主成分分析法進行分析，進而確定綜合評價指標。對不同濃度槲皮素處理的草莓的24項指標進行主成分分析，提取出3個主成分，累計貢獻率達100%，可代表原來的24個指標，其中第1主成分(Z1)占77.22%，第2主成分(Z2)占15.19%，第3主成分(Z3)占7.58%，它們對應的特征向量表達式為：

表3 不同濃度槲皮素對草莓各項指標的相關系數矩陣

Z1=-0.016 4X1+0.221 6X2+0.223 0X3+0.026 8X4+0.213 7X5+0.204 8X6+0.223 8X7+0.215 6X8+0.226 1X9+0.231 5X10+0.208 9X11+0.210 9X12+0.212 0X13+0.155 9X14-0.182 4X15+0.222 8X16+0.224 1X17+0.214 3X18+0.223 5X19+0.177 6X20-0.229 5X21+0.217 7X22+0.201 4X23+0.229 7X24；

Z2=-0.510 5X1-0.062 5X2-0.103 1X3-0.512 6X4-0.199 7X5-0.173 2X6-0.132 5X7-0.082 6X8+0.029 9X9+0.042 0X10+0.063 3X11+0.214 6X12-0.202 0X13+0.331 3X14+0.047 4X15+0.141 4X16+0.079 6X17-0.123 4X18-0.081 0X19+0.278 9X20-0.005 7X21+0.182 4X22+0.030 4X23+0.046 3X24；

Z3=0.156 5X1+0.204 4X2+0.147 5X3+0.124 5X4+0.067 3X5+0.249 1X6+0.064 1X7+0.249 5X8-0.164 2X9-0.017 8X10-0.311 3X11-0.064 2X12-0.099 2X13+0.286 7X14+0.454 0X15-0.062 6X16-0.159 6X17+0.226 9X18+0.166 2X19+0.269 2X20-0.114 1X21+0.015 5X22-0.367 0X23-0.089 9X24。

式中：X1～X24分別為株高、葉柄長、葉片數、花序數、結果數、葉面積、葉綠素含量、根莖粗、總質量、單果質量、果實縱徑、果實橫徑、果實硬度、可溶性固形物含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、總酚含量、總抗氧化能力、蒸騰速率、凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度。

由以上表達式可以看出，第1主成分中葉柄長、葉片數、葉綠素、總質量、單果質量、果實硬度、脯氨酸含量、可溶性糖含量、總酚含量、氣孔導度的系數較大；第2主成分中果實橫徑、可溶性固形物含量、總抗氧化能力、凈光合速率的系數較大；第3主成分中葉面積、根莖粗、可溶性固形物含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量的系數較大。

以所有綜合指標的數值為原始數據進行隸屬函數分析，換算成隸屬函數值(表4)。對于同一綜合指標如Z1，其中T3處理的U(X1)最大，表現最佳，而清水對照最小，表現最差。根據綜合評價值(D值)，對不同濃度槲皮素處理進行排序。結果顯示，不同處理按D值排序為40 mg/L處理>80 mg/L處理>20 mg/L處理>清水對照，其D值分別為0.948、0.822、0.592、0.125，說明40 mg/L槲皮素是最優處理劑量。

表4 不同濃度槲皮素處理的綜合指標值、隸屬函數值、D值及綜合評價

3 結論與討論

長江中下游地區在冬季(尤其是12月至次年2月)常有低溫弱光，嚴重影響草莓生產。從遺傳學角度分析可知，適合選用耐低溫弱光的草莓品種，但選育品種的費用、品種的適應性、生物學潛力的局限性及農民偏好有時會制約其使用；從栽培學角度分析可知，利用化學調控手段噴施主栽草莓品種，提高其耐低溫弱光能力是一種簡便可行的方式。近年來，植物生物刺激素的使用改善了植物耐逆境的水平[10]。

槲皮素是一種應用最廣泛的植物生物類黃酮，常存在于果樹、蔬菜中，有較強的抗氧化、抗逆能力，有望成為植物生物刺激素[14]。外源應用槲皮素能減輕獼猴桃葉片在夏季所受的高溫強光的灼傷[15]、延緩蘋果果實衰老[16]、延遲獼猴桃果實軟化、抑制擴展青霉的發生[17]、吸收UV-B光以保護豌豆幼苗[5]、提高滲透脅迫下羅布麻種子的發芽率和活力[4]、緩解番茄鹽脅迫[3]和百草枯毒性作用[18]。

槲皮素處理能有效增加草莓的結果數和單果質量，同時不同濃度的槲皮素顯著增加了草莓葉面積、葉柄長和根莖粗，這與槲皮素處理增加番茄幼苗莖高、莖圍和根長[6]并提高羅布麻種子的發芽率、莖長、根長、干質量和鮮質量的結果[7]相同。

槲皮素能夠提高植株的光合特性。逆境脅迫會破壞葉綠體和類囊體膜結構，降低葉綠素合成和氣孔導度，減少水分蒸騰，使光合作用降低。在本研究中，施用外源槲皮素增加了草莓葉片葉綠素含量，這與對番茄、羅布麻和小麥幼苗的研究結果相同[4，6-7]；槲皮素顯著促進了草莓植株的光合作用，其中40 mg/L槲皮素顯著提高了凈光合速率。各濃度槲皮素處理均提高了胞間CO2濃度、氣孔導度和蒸騰速率。槲皮素可以通過誘導類囊體膜的結構變化，影響電子傳遞，調控氣孔開放的信號通路，消除光抑制和對光合機構膜的損傷，導致光合效率提高[5]。

相關生理生化指標包括丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、抗氧化能力和總酚含量等植物應對逆境的指標。本研究發現，隨著槲皮素濃度升高，草莓體內的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量呈遞增趨勢，而丙二醛含量顯著降低，都有效減少了逆境中植株細胞受損；總抗氧化能力和酚類化合物總量與對照有顯著差異(P<0.05)，這與小麥幼苗中應用槲皮素增加了總抗氧化能力、酚類化合物總量的結果[17]相同。植物抗性的增加與多種因素有關，例如不良環境下植物體內活性氧的動態平衡被打破，植物就會啟動保護系統，清除過剩的自由基；脯氨酸含量提高會降低活性氧的水平，抑制丙二醛含量增加，從而減輕細胞膜脂過氧化，這與酚類捕獲活性氧的活力的作用相似；可溶性糖、可溶性蛋白含量的增加提高了草莓的代謝反應，以產生更多的滲透調節物質來緩解不良環境尤其是低溫弱光的傷害。

槲皮素以劑量依賴性的方式起作用，而最佳劑量證明對植物是有益的[18]。由本試驗結果可知，40 mg/L 槲皮素能夠有效提高凈光合速率、減少細胞膜損傷、提高草莓植株生長和抗性能力，可用于冬春季草莓生產。