煙嘧磺隆對甜玉米糖酵解和三羧酸循環途徑中關鍵物質的影響

蒙彥宇， 王 健， 李 云， 韓金玲， 韓玉翠， 楊 敏， 林小虎， 周印富

(河北科技師范學院，河北秦皇島 066004)

甜玉米(ZeamaysL. ssp.saccharataSturt)有水果玉米、蔬菜玉米之稱，具有廣闊的市場前景。為了迎合市場需求，玉米的品種選育逐漸向籽粒含高糖量方向發展，而甜玉米籽粒的高含糖量會降低種子活力，導致群體冠層生長發育緩慢，無法應對田間日益激烈的雜草競爭[1]。

因此，使用除草劑控制田間雜草是甜玉米生產的必然選擇。煙嘧磺隆是一種磺酰脲類內吸傳導型除草劑，常用于玉米田苗后雜草控制[2]。煙嘧磺隆的選擇性除草作用機制是基于玉米、雜草對其代謝的差異實現的。在煙嘧磺隆脅迫下，受害嚴重的玉米幼苗可出現大面積失綠、矮化、畸形，甚至死亡[3-4]。近幾年來，煙嘧磺隆得到廣泛使用，但其在甜玉米上應用的安全性還未得到全面驗證。

糖酵解是生物體取得能量的主要方式，其途徑是將葡萄糖、糖原降解為丙酮酸，生成的丙酮酸進入線粒體，通過三羧酸循環(TCA)途徑及電子傳遞鏈徹底氧化成二氧化碳和水，并生成三磷酸腺苷(ATP)[5-6]。任曉松等研究發現，低溫脅迫會降低玉米種子的糖酵解、TCA途徑和磷酸戊糖途徑的轉運效率[7]。薛梅真等研究發現，人工老化處理使己糖激酶(HK)活性升高，ATP含量降低，最終會影響玉米種子的發芽率[8]。Hao等研究發現，干旱脅迫條件會導致玉米根部糖類物質和相關酶的基因表達量發生改變[9]。

糖代謝途徑是植物獲取能量的主要方式，關于逆境脅迫對植物體內糖酵解和TCA途徑的影響已被廣泛報道[10-11]，但是關于煙嘧磺隆脅迫對甜玉米植株體內糖酵解、TCA途徑的影響則鮮有報道。本研究的前期結果表明，煙嘧磺隆脅迫導致敏感性甜玉米HK320的光合特性值、葉綠素熒光參數顯著降低，PSⅡ反應中心失活，C4途徑代謝活動下降，將影響甜玉米體內的物質合成和積累[12-13]。在此研究基礎上，本研究繼續從糖酵解、TCA途徑角度解析煙嘧磺隆脅迫下甜玉米的耐藥生理機制，以期為減緩苗后除草劑對甜玉米的毒害作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和藥劑

供試材料為河北科技師范學院選育的1對對煙嘧磺隆表現出耐藥差異的甜玉米姊妹系，分別為耐藥性甜玉米自交系HK301、敏感性甜玉米自交系HK320。

試驗藥劑為日本石原產業株式會社生產的 40 g/L 煙嘧磺隆可分散油懸浮劑。

1.2 試驗設計

試驗開始于2018年，在河北科技師范學院昌黎試驗站進行。前期除草劑濃度的篩選試驗結果表明，在玉米苗4葉1心期，當噴施藥劑濃度為 36 mg/hm2時，HK301可以正常生長，HK320最終死亡[3]。因此，后續試驗選擇36 g/hm2作為田間噴施煙嘧磺隆的濃度。

2020—2021年在河北科技師范學院昌黎試驗站進行大田試驗。大田試驗采用隨機區組設計，小區面積為38.4 m2，設3次技術重復。設置藥劑噴施濃度為36 g/hm2，以噴施清水作為對照。在玉米4葉1心期時噴藥，分別在噴藥后1、3、5、7 d采集不同處理的葉片樣品置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中，用于葡萄糖(GLU)、丙酮酸(PA)、檸檬酸(CA)、草酰乙酸(OAA)、蘋果酸(MDH)、三磷酸腺苷(ATP)和6-磷酸葡萄糖(6PG)含量(以鮮質量計)的測定與己糖激酶(HK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性(以鮮質量計)的測定。

1.3 測定項目與方法

參照李圓圓的方法[14]進行GLU含量的測定；參照Braithwaite等[15]、Martinez-Barajas等的方法[16]進行HK活性的測定；參照Gonzalez等的方法[17-18]進行PEPC活性的測定；參照孟德義的方法[19]進行PA含量的測定；參照Yang等的方法[20]進行CA含量的測定；參照崔曉慧的方法[21]進行OAA含量的測定；參照尹志梅等的方法[22]進行MDH含量的測定；參照應漢杰等的研究方法[23]進行6PG含量的測定；參照劉俊芳等的方法[24]進行ATP含量的測定。

1.4 數據處理

采用 Excel 2007和SigmaPlot 12.5進行數據處理與作圖，用SPSS 22.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 煙嘧磺隆對甜玉米糖酵解途徑的影響

2.1.1 煙嘧磺隆對甜玉米中葡萄糖含量的影響 由圖1可知，在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK301的GLU含量呈先上升后下降的趨勢，在用煙嘧磺隆脅迫處理5 d后達到最大值。用煙嘧磺隆脅迫處理 3 d 后，HK301的GLU含量較對照(HK301-CK)增加41.62%，差異達到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的GLU含量呈持續上升的趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d后，HK320的GLU含量與對照(HK320-CK)相比沒有顯著差異；用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK320的GLU含量分別較對照(HK320-CK)增加了21.56%、22.80%，差異達到顯著水平(P<0.05)。對2個自交系甜玉米的GLU含量進行比較發現，用煙嘧磺隆脅迫處理1、7 d后，HK301的GLU含量分別較HK320低46.27%、62.80%，并且差異達到顯著水平(P<0.05)。

2.1.2 煙嘧磺隆對甜玉米中6-磷酸葡萄糖含量的影響 由圖2可知，煙嘧磺隆脅迫處理顯著提高了HK301、HK320的6PG含量。在煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d，HK301的6PG含量分別較對照(HK301-CK)增加了52.04%、64.07%、72.69%、50.19%，并且差異顯著。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d 后，HK320的6PG含量與對照(HK320-CK)間沒有顯著差異，用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK320的6PG含量分別比對照(HK320-CK)增加了48.77%、59.37%，差異達到顯著水平(P<0.05)。

2.1.3 煙嘧磺隆對甜玉米中丙酮酸含量的影響 由圖3可知，在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK301的PA含量較對照顯著增加。在噴藥后1、3、5、7 d，HK301的PA含量分別比對照(HK301-CK)增加了36.78%、29.67%、46.87%、26.22%，差異達到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、7 d后，HK320的PA含量分別較對照(HK320-CK)增加了30.80%、22.92%、27.37%，差異達到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理5 d后，PA含量較對照(HK320-CK)顯著降低了21.35%。

2.1.4 煙嘧磺隆對甜玉米中己糖激酶活性的影響 由圖4可知，隨著煙嘧磺隆脅迫處理時間的延長，HK301的HK活性呈上升趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的HK活性與對照(HK301-CK)相比分別增加了54.66%、55.48%、67.22%、17.83%(P<0.05)，并且差異顯著。隨著煙嘧磺隆脅迫時間的增加，HK320的HK活性總體呈先上升后下降的趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK320的HK活性分別較對照(HK320-CK)增加了51.07%、49.84%、51.06%、72.64%，差異達到顯著水平(P<0.05)。煙嘧磺隆脅迫處理顯著改變了2個自交系甜玉米的HK活性，用煙嘧磺隆處理1、3、5 d后，HK301的HK活性分別較HK320降低了64.18%、51.92%、82.56%。

2.1.5 煙嘧磺隆對甜玉米中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的影響 由圖5可知，用煙嘧磺隆脅迫處理5 d后，HK301的PEPC活性達到最大值，隨后呈下降趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的PEPC活性分別較對照(HK301-CK)增加了0.17%、45.12%、62.42%、60.49%，差異達到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的PEPC活性呈持續下降的趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1 d后，HK320的PEPC活性與對照(HK320-CK)相比無顯著變化，而用煙嘧磺隆脅迫3、5、7 d后，HK320的PEPC活性分別較對照(HK320-CK)減少了30.04%、50.57%、67.35%，差異達到顯著水平(P<0.05)。隨著煙嘧磺隆脅迫處理時間的延長，2個自交系甜玉米的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性間的差異顯著。在各個時間點，HK301的PEPC活性分別較HK320高38.81%、56.86%、80.31%、82.18%，差異達顯著水平(P<0.05)。

2.2 煙嘧磺隆對甜玉米三羧酸途徑的影響

2.2.1 煙嘧磺隆對甜玉米中蘋果酸含量的影響 由圖6可知，2個自交系的MDH含量均在噴藥后 1 d 達到最大值，隨后呈下降趨勢，并且HK320的下降速率更大。在煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的MDH含量分別較對照(HK301-CK)增加了67.06%、44.35%、28.02%、14.77%，差異達到顯著水平(P<0.05)。除噴藥后1 d，噴藥后3、5、7 d，HK320的MDH含量分別較對照(HK320-CK)顯著減少22.89%、53.41%、71.08%。噴藥后HK301、HK320的MDH含量呈現相同的趨勢，但HK301分別比HK320高28.24%、56.79%、66.61%、73.72%，差異顯著。

2.2.2 煙嘧磺隆對甜玉米中草酰乙酸含量的影響 由圖7可知，隨著噴藥天數的增加，2個自交系的OAA含量呈現不同的變化趨勢。煙嘧磺隆脅迫處理顯著增加了HK301的OAA含量，并且在脅迫后 1 d 達到最大值。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK301的OAA含量分別較對照(HK301-CK)增加了40.74%、38.46%、37.50%、36.00%，差異達到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的OAA含量呈先上升后逐漸下降的趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5 d后，HK320的OAA含量分別較對照(HK320-CK)增加了24.99%、30.04%、15.61%，用煙嘧磺隆脅迫處理7 d后，HK320的OAA含量比對照(HK320-CK)低12.11%，并且差異達到顯著水平(P<0.05)。對比2個自交系的OAA含量可知，在噴藥后的各個時間點，HK301的OAA含量分別比HK320高18.76%、16.01%、21.50%、47.60%，差異達到顯著水平(P<0.05)。

2.2.3 煙嘧磺隆對甜玉米中檸檬酸含量的影響 由圖8可知，在煙嘧磺隆脅迫處理下，隨著時間的增加，HK301的CA含量呈先下降后上升的趨勢，并且在脅迫后1 d達到最小值。在煙嘧磺隆脅迫處理 1 d 后，CA含量比對照(HK301-CK)低41.49%，并且差異顯著；用煙嘧磺隆脅迫處理7 d后，HK301的CA含量比對照(HK301-CK)高43%，差異達到顯著水平(P<0.05)。在煙嘧磺隆脅迫處理下，HK320的CA含量呈持續上升的趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3、5、7 d后，HK320的CA含量分別較對照(HK320-CK)增加了58.73%、35.78%、44.52%、43.79%，差異達到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理7 d后，HK301的CA含量比HK320高34.53%，并且差異顯著。

2.2.4 煙嘧磺隆對甜玉米三磷酸腺苷的影響 由圖9可知，用煙嘧磺隆處理后，HK301的ATP含量呈先上升后緩慢下降的趨勢。用煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d后，HK301的ATP含量分別較對照(HK301-CK)增加了36.87%、58.00%，并且差異達到顯著水平(P<0.05)。用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK301的ATP含量與對照(HK301-CK)相比未有顯著改變。用煙嘧磺隆處理后，HK320的ATP含量在煙嘧磺隆脅迫處理1、3 d后呈上升趨勢，但HK320的ATP含量與對照間無顯著差異，用煙嘧磺隆脅迫處理5、7 d后，HK320的ATP含量突然下降，與對照(HK320-CK)的ATP含量相比，分別顯著減少57.45%、63.67%。用煙嘧磺隆脅迫后的1、3、5、7 d，2個自交系的ATP含量都有下降趨勢，并且HK301的ATP含量分別比HK320高36.16%、23.66%、76.23%、72.57%。

3 討論與結論

筆者的前期研究結果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，相較于耐藥性甜玉米自交系HK301，敏感性甜玉米自交系HK320的凈光合速率、氣孔導度顯著下降，說明煙嘧磺隆脅迫會影響玉米的光合特性，進而導致其物質積累和呼吸速率發生變化[25]。本研究從糖酵解和TCA途徑的角度進一步探討煙嘧磺隆脅迫對甜玉米自交系呼吸代謝、物質消耗的影響，解析甜玉米對煙嘧磺隆的耐藥性。

糖酵解途徑存在于生物體內，可為生命活動提供能量[26]。HK是糖酵解途徑的限速酶，是六碳糖進入糖酵解途徑的關鍵酶[27-28]。GLU通過HK形成6PG，隨后6PG經過一系列反應形成PA[29]。本研究結果表明，相較于耐藥性自交系HK301，HK320的GLU和6PG含量顯著升高，HK的活性顯著增強。說明受到煙嘧磺隆危害時，植物體內可能需要消耗更多糖分物質為機體提供能量，因此對煙嘧磺隆越敏感的品種，其糖類物質含量升高得越快。謝美華等研究發現，干旱脅迫下玉米幼苗葉片的可溶性糖含量隨著脅迫天數的增加而增加[30]。本研究結果與前人研究結果一致，即PEPC在PEPC酶作用下形成OAA[31]。本研究結果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，相較于HK301，HK320的PEPC活性顯著降低，表明煙嘧磺隆脅迫會影響植物糖酵解的最終產物含量。郭書奎等研究發現，在NaCl脅迫下，玉米幼苗的PEPC活性顯著降低[32]。在煙嘧磺隆脅迫下，敏感性甜玉米PEPC活性的降低可能導致糖酵解途徑物質積累過多。

TCA途徑是在有氧條件下，EMP的最終產物PA進入線粒體，形成CO2、H2O的過程[33]。MDH酶是TCA途徑的關鍵酶，它催化蘋果酸脫氫生成OAA、NADH，是TCA途徑反應的最后一步，可以反映TCA途徑的活化程度[34-35]。本研究結果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，2種自交系甜玉米中敏感性HK320的MDH含量隨著脅迫時間的延長而顯著降低。任淑娟的研究發現，MDH活性較高，表明有氧呼吸作用強，植物體內各種代謝活動旺盛[36]。由此可見，2種自交系甜玉米的TCA途徑的活化程度受到除草劑影響且呈下降趨勢。本研究結果表明，在煙嘧磺隆脅迫下，HK301、HK320與對照(HK301-CK和HK320-CK)相比OAA、CA含量顯著升高。黃愛纓等研究發現，在低磷脅迫下，玉米自交系苗期根部的OAA、CA含量顯著增多[37]。本研究結果與前人研究結果一致。Samanta等研究發現，水稻在砷脅迫下呼吸代謝代表性有機酸和酶受到調節[38]。在煙嘧磺隆脅迫下，相較于HK301，HK320的ATP含量顯著降低。段乃彬等研究發現，在低溫脅迫下，玉米種子的ATP含量明顯降低[39]。由此可見，苗后除草劑會影響甜玉米的TCA途徑的正常代謝速率，導致植株生長減緩，甚至死亡。

在煙嘧磺隆脅迫下，相較于耐藥性自交系HK301，敏感性自交系HK320的糖類物質(GLU、6PG)積累加快，呼吸代謝的關鍵物質(PA、OAA、MDH、CA、ATP)含量及關鍵酶(PEPC)活性顯著降低。研究發現，煙嘧磺隆脅迫影響不同耐藥性甜玉米的糖代謝程度。本研究結果將為解決煙嘧磺隆除草劑對甜玉米的糖代謝途徑的毒害作用、提高甜玉米對煙嘧磺隆耐藥性提供理論依據。