糜子萌芽期耐冷種質資源綜合評價體系構建

董 揚

(黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

糜子(PanicummiliaceumL.)是C4作物，能忍受鹽堿、干旱、高溫等極端條件[1]，是干旱、半干旱地區的重要特色雜糧作物[2]。我國具有豐富的糜子種質資源，目前共收集10 200余份，國家已存儲 8 850 余份，尤其是地方品種資源較多[3]，具有廣泛的遺傳變異性和豐富的抗逆基因[4-5]。糜子的生育期短，是東北等冷涼地區的救災抗逆作物，在北方有較大的生產優勢和地區優勢。

植物的耐冷性是指作物個體對低溫冷害所表現出的抵抗性或耐受性[6]，是植物對低溫逆境而表現出的一種生理應激反應[7]。農業生產中，減輕低溫冷害所造成的損失最有效的手段就是選用耐冷品種，而農作物耐冷性評價體系的建立是鑒定和篩選耐冷種質資源的基礎與前提[8]。種子在萌發階段對低溫反應最為敏感，低溫破壞了種子細胞的生物活性，從而大幅度地降低了種子的發芽勢、發芽率、發芽指數等[9]。近些年，在耐冷性鑒定分析評價方法上，前人已經做了大量工作，種子萌發的時間和活力最先受到低溫影響[10]。環境溫度越低，種子萌發所需的時間越長[9]。長時間的萌發會使種子受到土壤中病原菌的侵害，使種子腐爛，降低發芽率[11-12]。在種子萌發期，發芽率、發芽勢、發芽指數、根長、芽長等指標會發生不同程度的變化，是植物受到低溫脅迫最直接、具體的表現[13-14]。徐偉豪將冷脅迫14 ℃條件下水稻芽期的發芽率設置5個耐冷評價標準，發芽率>90%為極強，80%<發芽率≤90%為強，70%<發芽率≤80%為中，60%<發芽率≤70%為弱，發芽率≤60%為極弱[15]。Marocco等的研究表明，玉米的最適生長溫度為 25～28 ℃，在溫度低于10 ℃時植株生長會變得明顯緩慢，6～8 ℃ 時就不再生長發育[16]。王俊娟等的研究表明，棉花最低萌發溫度為10～12 ℃，最適溫度為 20～30 ℃[17-18]。辣椒的適宜發芽生長溫度在20～30 ℃ 之間，長時間在12 ℃以下生長會受到冷害[19]。唐雙勤等設計 5、8、10 ℃等3 個低溫處理直播秈稻，結果表明 8 ℃處理最適鑒別品種間耐冷性差異[20]。楊光等對296份玉米自交系進行了耐冷性鑒定研究，結果表明在4 ℃低溫下，yw9706自交系全部發芽，而自交系龍抗11完全沒有發芽[21]，說明同一作物不同品種間耐冷性存在差異。糜子種子發芽最適溫度為20～30 ℃[22]，當溫度低于 12 ℃ 時容易對糜子造成冷害脅迫[23]。

目前，對糜子的研究主要集中在抗旱、抗倒伏和抗鹽堿等抗逆方面[24-26]，對耐冷能力的研究鮮見報道。本研究以240份糜子種質資源為參試材料，通過逐級低溫篩選，確定糜子的最低發芽溫度，通過萌發期不同低溫處理，調查耐冷性相關指標，并利用模糊數學隸屬函數、正態分布檢驗、相關性分析、主成分分析等統計方法進行綜合分析，以期建立糜子耐冷性綜合評價體系，為耐冷糜子品種資源的鑒定提供方法，并對資源加以利用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2021年在黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院實驗室內進行，該科研基地(123°45′E，47°15′N)位于黑龍江省西部干旱半干旱地區，海拔141 m，年平均氣溫為3.37 ℃，積溫為2 600～2 700 ℃，生長季總降水量為415 mm。試驗材料是從適宜在該科研基地種植的820份糜子品種資源中，根據2017—2019年測量的株高、落粒性、穗質量、千粒質量等農藝性狀和產量性狀指標初步篩選出的240份優質糜子資源，選種以來源廣泛、適宜當地種植、成熟度好、農藝性狀和產量性狀突出為原則。

240份糜子資源來自21個國家，其中我國資源209份，國外資源31份，我國資源中包括新疆11份、山西27份、寧夏16份、陜西16份、青海10份、內蒙古33份、黑龍江31份、遼寧8份、西藏1份、吉林8份、云南2份、山東7份、江蘇3份、甘肅17份、湖北1份、海南2份、北京3份、河北13份。

1.2 試驗設計

將糜子種子在1%的NaClO溶液中消毒15 min后，用自來水沖洗5 min，將種子置于陰涼通風處陰干后置于鋪有3層濾紙的大號培養皿中，每個培養皿中均等擺放籽粒飽滿、大小顏色一致的種子30粒。將培養皿置于人工氣候箱內，每個試驗均設置3次重復。設25 ℃(對照)及12、10、8、6、4 ℃ 6個溫度處理試驗，黑暗24 h，設置濕度為70%。

1.2.1 耐冷種子最低發芽溫度試驗方法 將240份糜子資源逐級放入25、12、10、8、6、4 ℃中篩選，25、12、10 ℃處理的發芽率以80%為標準，發芽率≥80%的資源進入下一水平低溫處理，8、6、4 ℃處理的發芽率以60%為標準，發芽率≥60%的資源進入下一水平低溫處理。

1.2.2 最適低溫篩選試驗方法 為確定糜子萌發期耐冷性鑒定的最適溫度，根據不同地域來源從供試糜子資源中隨機選出25份材料，分別于25、12、10、8、6 ℃(試驗“1.2.1”節確定出的最低發芽溫度)5個溫度條件下處理10 d，之后轉入25 ℃條件下恢復生長6 d。每個試驗均設置3次重復。低溫脅迫處理期間無光照，生長恢復階段07：00—19：00光照，每天12 h，設置2 500 lx的光照強度和70%的相對濕度。每天記錄發芽過程中的發芽粒數，計算發芽指數，生長恢復第3天測定發芽勢，第6天測發芽率，并計算活力指數。

1.2.3 萌發期耐冷性鑒定試驗 將240份糜子資源分別放在10 ℃(最適低溫篩選溫度)和25 ℃(對照)2個溫度條件下萌發，培養方法同“1.2.2”節。發芽過程中每天記錄發芽粒數，計算出發芽指數，恢復生長第3天測定發芽勢，第6天測定發芽率、根長、根鮮質量、芽長、芽鮮質量，計算活力指數和冷害率等。根長為從種胚到最長根尖的長度；芽長為從種胚到最長葉尖的長度。萌發期生長指標計算公式如下：發芽勢=第3天發芽種子數/處理種子數×100%；發芽率=第6天發芽種子數/處理種子數×100%；發芽指數=∑(第n天的發芽種子數/相應發芽天數)；活力指數=發芽指數×胚根鮮質量；發芽相對冷害率=(對照發芽率-處理發芽率)/對照發芽率×100%；相對值=各指標處理值/對照值。

1.3 數據處理與分析

用Excel 2019軟件進行數據統計分析，用SPSS 19.0軟件進行相關性分析、主成分分析，用R studio軟件進行聚類分析。

采用標準差系數賦予權重法[27]進行耐冷性綜合評價：采用公式(1)計算隸屬函數值，用公式(2)計算標準差系數，用公式(3)計算各指標的權重，用公式(4)計算各材料的綜合評價值。

(1)

式中：U(Xj)表示第j個指標的隸屬函數值；Xj表示第j個綜合指標；Xmin表示第j個綜合指標的最小值；Xmax表示第j個綜合指標的最大值。

(2)

(3)

(4)

式中：D表示各品種用綜合指標評價所得的綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 低溫萌發溫度評價

2.1.1 糜子萌發期最低發芽溫度的確定 對240份糜子資源進行逐級降溫篩選，結果(圖1)表明，在25 ℃萌發時出芽率均大于98%，說明參試糜子資源種子質量良好，因此全部進行逐級低溫發芽試驗。在12 ℃溫度下發芽率大于80%的糜子資源有195份，占總數的81.25%，195份資源在10 ℃培養箱中發芽率大于80%的糜子資源有164份，占總數的68.33%，164份資源在8 ℃培養箱中發芽率大于60%的資源有84份，占總數的35.00%，將篩選出的84份糜子放入6 ℃培養箱中發芽，結果顯示發芽率大于60%的糜子資源有22份，占總數的9.16%，22份糜子資源在4 ℃培養箱中均沒有發芽。因此，糜子萌發期最低發芽溫度為6 ℃。

2.1.2 不同低溫處理下各指標的耐冷響應 由表1可知，在12、10、8、6 ℃低溫脅迫下，25份糜子資源的4個發芽性狀均表現出不同程度的下降趨勢，且各指標的相對值大部分都小于1，平均值均小于1，說明4個低溫處理對25份糜子的萌發均造成一定程度的冷害，并且相對發芽勢的變異系數范圍為9.12%～113.14%，相對發芽率的變異系數范圍為7.10%～89.42%，相對發芽指數的變異系數范圍為8.01%～94.33%，相對活力指數的變異系數范圍為17.12%～105.00%，表明測定的指標對4個低溫反應敏感，通過對供試材料萌發期相對指標的統計分析可知，25份抽選樣本的遺傳多樣性較高，能夠代表240份參試糜子材料，可以進一步分析以確定糜子耐冷性評價的最適溫度。

2.1.3 確定最適耐冷性評價溫度 確定篩選耐冷糜子資源的最適低溫，用隸屬函數法計算出25個糜子資源在4個低溫下的芽期指標綜合得分(D)(表2)，對D進行正態分布檢驗和QQ-Plot分析(圖2)。

表1 不同低溫處理下25份糜子材料的萌發表現

從圖2-A可以看出，12、10、8 ℃正態分布檢驗的峰度值分別為-0.90、-0.72、-1.46，均小于0，呈平頂峰，6 ℃處理下的峰度值為1.46，大于0，呈尖頂峰，10 ℃的峰度值最接近于0，6 ℃正態檢驗偏度值為1.36，呈較大程度的正向偏離，12、10、8 ℃的偏度值分別為 -0.62、-0.12、-0.43，均小于0，呈負向偏離。結果表明10 ℃處理下的偏度絕對值僅為0.12，是所有處理中偏度最小的，正態分布擬合度最高。隸屬函數的QQ-Plot分析結果(圖2-B)表明，25份糜子材料在10 ℃處理下相對發芽勢、相對發芽率、相對發芽指數和相對活力指數的隸屬函數值與趨勢線擬合度最高(R2=0.985)，最符合正態分布。所以，10 ℃處理為篩選耐冷糜子資源的最適溫度。

2.2 萌發期耐冷性評價

2.2.1 萌發期糜子資源對冷脅迫的響應 從表3可以看出，在10 ℃條件下240份糜子品種資源萌發期的各項指標與對照比的相對值大部分都小于1，平均值均小于1，說明10 ℃低溫處理對參試材料的萌發造成了一定程度的冷害。相對發芽勢的范圍為0.00～1.00，相對發芽率的范圍為0.08～1.00，相對發芽指數的范圍為0.02～0.38，相對芽長的范圍為0.09～0.93，相對根長的范圍為0.21～2.98，相對芽鮮質量的范圍為0.03～1.33，相對根鮮質量的范圍為0.18～2.13，相對活力指數的范圍為0.02～0.69，相對發芽冷害率的范圍為0.00～0.92。其中，相對根鮮質量、相對活力指數、相對發芽冷害率的差異性較大，變異系數分別是43.33%、58.45%、100.03%。表明不同品種資源的耐冷性存在差異，具有豐富的遺傳多樣性，參試材料的測定指標對 10 ℃ 低溫脅迫反應敏感，測試材料可作為在冷脅迫下鑒定耐冷性狀的品種資源。

2.2.2 萌發期冷脅迫下各性狀的相關性分析 從相關性分析結果(表4)可以看出，相對發芽勢、相對發芽率、相對發芽指數分別與相對芽鮮質量、相對根鮮質量、相對活力指數、相對冷害率等指標間呈極顯著負相關(P<0.01)；相對根長與相對發芽率呈顯著正相關(P<0.05)，與相對芽鮮質量、相對根鮮質量、相對活力指數、相對冷害率呈顯著負相關(P<0.05)，與相對芽長、相對發芽指數、相對發芽勢呈極顯著正相關(P<0.01)；相對發芽勢、相對發芽率、相對芽長、相對發芽指數這4個指標相互間均呈極顯著正相關(P<0.01)；相對根鮮質量、相對芽鮮質量、相對活力指數、相對冷害率這4個指標相互間均呈極顯著正相關(P<0.01)。相對發芽勢、相對發芽率和相對發芽指數相互間的相關系數均大于0.80，相對芽鮮質量、相對活力指數和相對根鮮質量相互間的相關系數均大于0.90，說明各性狀間受到冷脅迫后的響應是相互關聯的。

表3 萌發期10 ℃冷脅迫下各性狀相對值的統計分析結果

表4 萌發期冷脅迫下各性狀相對值的相關系數

2.2.3 萌發期冷脅迫下糜子測量性狀相對值的主成分分析 對240份糜子冷脅迫下9個相對性狀進行主成分分析，選取3個特征值大于1的主成分。由表5可知，第1主成分的貢獻率為52.57%，第2主成分的貢獻率為22.87%，第3主成分的貢獻率為11.78%，累計貢獻率為87.22%，表明3個主成分涵蓋了9個相對指標87%以上的數據信息。由表6可知，9個性狀相對值的變化趨勢可以通過前3個主成分代表，它們之間的相關性可通過因子載荷量反映出來。 第1主成分與相對發芽勢、相對發芽率和相對發芽指數呈較大的正相關，表明冷脅迫下糜子發芽性狀可作為耐冷性評價的重要指標。第2主成分與相對芽鮮質量和相對根鮮質量呈較大的正相關，表明冷脅迫與種子發芽后的鮮質量有較大關系。第3主成分與相對根長呈較明顯的正相關，表明根長對其起主要作用。

表5 3個主成分的特征值以及貢獻率

表6 各因子載荷矩陣

3 討論

3.1 糜子耐冷溫度評價

近年來，各國學者對不同農作物種子萌發期耐冷性方面做了大量研究。張鶴等采用模糊數學隸屬函數方法研究認為，花生萌發期進行耐冷性評價最佳耐冷溫度為6 ℃[28]；孫世臣等研究發現，寒地水稻耐冷性評價最適溫度為10 ℃[29]。雖然前人對多種作物種子萌發期的耐冷性做了大量研究，但在處理糜子的耐冷低溫和評價指標上還未見報道，因此，確定糜子耐冷性評價的適宜溫度條件是進行糜子耐冷性鑒定工作的前提。本研究以240份糜子種質資源為參試材料，分別在 25、12、10、8、6、4 ℃的低溫條件下處理，逐級篩選后發現，部分糜子可在6 ℃發芽，而在4 ℃條件下未見發芽，因此在25、12、10、8、6 ℃的溫度下，對根據不同地域來源隨機選出25份材料進行處理，分別測定低溫條件下的相對發芽勢、相對發芽率、相對發芽指數和相對活力指數作為評價指標，利用標準差系數賦予權重法、標準正態分布檢驗和QQ-Plot對數據進行分析，結果顯示在6、8 ℃低溫條件下萌發糜子對種子的活力影響較大，無法對耐冷能力進行準確判斷；在12 ℃低溫條件下種子萌發對活力的影響較小， 品種間的差異并不顯著；10 ℃處理后的各項活力指標均呈明顯的正態分布，且品種間差異顯著。因此，在低溫10 ℃時對糜子種子做耐冷發芽試驗可作為糜子種質資源的耐冷性鑒定條件。糜子耐冷性篩選的最適溫度與寒地水稻[29]、玉米雜交種[30]等相同，但與花生[28]和高粱[31]等作物相比有所提高。說明不同作物的最適耐冷性評價溫度存在差異。

3.2 糜子萌發期耐冷性狀評價

目前還未見有糜子資源萌發期耐冷性狀的評價。袁雨豪等對100份糜子資源通過鹽脅迫測定萌發期的發芽率、發芽勢、發芽指數等指標，通過主成分分析，確定糜子萌發期耐鹽性鑒定性狀指標[26]。本研究以240個糜子品種資源為試驗材料，測定 10 ℃ 低溫脅迫下糜子萌發期的相對發芽率、相對發芽勢、相對冷害率等指標(以25 ℃為對照)，通過相關性分析，發現耐冷性狀之間受到冷脅迫的程度是相互關聯的。主成分分析后將發芽率、發芽勢和發芽指數作為糜子萌發期耐冷性的鑒定指標，與油菜[32]、水稻[33]等作物的耐冷性鑒定指標有一定相似性。

4 結論

通過逐級降溫法發現部分糜子的最低發芽溫度為6 ℃，利用標準差系數賦予權重法計算綜合隸屬函數值，通過正態分布等確定最適耐冷性評價溫度，結合主成分分析建立糜子資源萌芽期耐冷綜合評價體系：在萌發期，10 ℃處理，以發芽率、發芽勢和發芽指數作為耐冷性鑒定指標。