辣椒八氫番茄紅素合成酶鑒定、進化與表達分析

鄭佳秋， 梅 燚， 吳永成， 王薇薇， 張麗娜， 張永吉， 陳以博， 祖艷俠， 萬紅建

(1.江蘇沿海地區農業科學研究所，江蘇鹽城 224002； 2.浙江省農業科學院，浙江杭州 310021；3.江蘇里下河地區農業科學研究所，江蘇揚州 225007)

辣椒(CapsicumannuumL.)原產于中南美洲熱帶亞熱帶地區，富含維生素C和辣椒素，營養價值豐富，在我國有著悠久的栽培歷史，年種植面積約200萬hm2，在我國蔬菜周年供應中起重要作用。辣椒成熟果實顏色主要由果實中類胡蘿卜素組分及其相對含量決定。類胡蘿卜素是光吸收復合體的重要組成成分，主要分布在植物有色體和葉綠體膜中，在保護光合作用器官、防止光氧化損傷等方面發揮了重要作用[1-2]。類胡蘿卜素合成需經過縮合、脫氫、環化等一系列反應[3]，而八氫番茄紅素合成酶(PSY)既是類胡蘿卜素合成途徑的首要限速酶，又是控制碳源流向的首要關鍵酶，分別誘導PSY基因組成型和功能型特異表達，可顯著提高植物非綠色組織中的類胡蘿卜素含量，PSY基因已成為植物類胡蘿卜素基因工程改良主要目的基因[4-7]。

鑒定和分析辣椒果實中的PSY(CaPSY)基因對揭示其在辣椒類胡蘿卜素合成及果色形成中的作用具有重要理論意義。前人研究認為，成熟時辣椒果實的顏色由3對獨立的基因y、c1、c2控制[8]。Lefebvre等研究發現，辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶基因(Ccs)控制紅色果實和黃色果實的遺傳差異，與前人研究命名的y基因相對應，定位在6號染色體上[9-10]。而Thorup等認為，八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)調控紅色與橙色果實的遺傳差異[11-12]，該基因與前人研究認為的c2位點相對應，調控果實中類胡蘿卜素的含量。Tian等應用病毒誘導沉默辣椒紅素生物合成途徑上的4個關鍵基因(Psy、Lcyb、Crtz、Ccs)以研究辣椒果實顏色的形成，發現單獨沉默和同時沉默幾個關鍵基因時，基因表達水平均降低，辣椒紅素合成減少，果實呈現黃色或橙色[13]，這與前人研究認為的紅色是顯性由位于6號染色體y位點的單獨基因控制的觀點[14]不一致。進一步研究發現，當沉默PSY基因時，β-胡蘿卜素、β-隱黃質、玉米黃質、辣椒紅素含量顯著減少，表明沉默PSY基因負面影響了辣椒紅素生物合成途徑的中間產物，從而引發辣椒紅素含量的降低，表現出正常果實與沉默果實顏色的明顯不同，可見PSY基因在辣椒果實顏色形成過程中的重要作用。

目前，PSY基因在草莓、甜橙、小麥等植物上已有相關研究，而辣椒PSY基因家族的鑒定和生物信息學分析方面報道較少。本研究對辣椒及其他植物PSY基因進行鑒定分析系統發育關系，對鑒定出的辣椒PSY基因家族成員進行生理和結構分析，并熒光定量分析組織表達特異性，有助于了解辣椒PSY基因的功能和結構特征，為進一步探索辣椒果色形成的分子機制提供一些理論依據，為創制不同果色新種質資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 CaPSY基因家族的鑒定

利用植物PSY基因隱馬爾科夫(HMM)模型對辣椒2個全基因組數據庫PGP(http：//peppergenome.snu.ac.kr/)和Pepper Genome Database 2.0(http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/index/jsp)進行搜索，獲得辣椒PSY基因相關信息，通過Pfam(http：//pfam.janelia.org/)進行鑒定。其他植物的八氫番茄紅素合成酶基因信息來源于Phytozome數據庫(https：//phytozome.jgi.doe.gov/)。

1.2 CaPSY基因家族的系統發生學和染色體定位分析

利用pI/Mw工具(http：//web.expasy.org/compute_pi/)計算等電點和分子量。外顯子-內含子結構模式圖由Gene Structure Display Server(GSDS)繪制。通過ClustalX軟件對獲得的CaPSY基因進行氨基酸序列比對，再用MEGA 11.0軟件采用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法，校驗參數Bootstrap設為1 000次重復，構建系統進化樹。利用MEME (http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi) 分析保守基序。用DNAMAN 6.0軟件分析序列間的相似性。結合辣椒基因組數據庫中獲得的辣椒PSY基因位置信息，利用MapDraw 2.1進行染色體定位，在線(http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus)分析這些基因的串聯重復和片段重復特征。

1.3 試驗材料與方法

辣椒品種為Y28，種子由江蘇沿海地區農業科學研究所蔬菜花卉研究室提供，2016年種植于江蘇省鹽城市南洋試驗場。辣椒種子先用55 ℃溫水處理20 min后，放在28 ℃水中浸泡 6 h，取出種子用濕紗布包好，28 ℃黑暗光照培養箱中進行催芽，每天用自來水沖洗1次，大約4 d種子露白，播于穴盤中育苗，放在塑料大棚中進行生長，培養條件：晝溫為20～25 ℃，夜溫為10～15 ℃。當幼苗長至4葉1心時，取根、莖、葉組織，液氮取樣后在-80 ℃超低溫冰箱中存放備用。辣椒幼苗長至 8～10張真葉時移栽到露地，3個月后果實成熟時，取花、嫩果(花后15 d)、成熟青果(花后30 d)、轉色期果實(花后40 d)、成熟紅果(花后50 d)作為樣品，液氮取樣后在-80 ℃超低溫冰箱中存放備用。

采用RNASEOUT RECOMB.RNASE INHIB提取試劑盒(Invitrogen公司)，參考說明書分別提取根、莖、葉、花、嫰果、成熟青果、轉色期果實、成熟紅果的總RNA。參照SUPERSCRIPT Ⅲ TRANSCRIPT試劑盒(Invitrogen公司)說明書合成cDNA。CaPSY基因特異引物用Prime 5軟件設計，以UBI作為內參檢測基因。

1.4 CaPSY基因家族的表達特性分析

采用實時定量PCR檢測CaPSY基因組織特異性表達，反應體系為20 μL，包括10 μL 2× SYBR premix ExTaqTM，1 μL cDNA(稀釋10倍)，0.4 μL上游引物(10 μmol/L)，0.4 μL下游引物(10 μmol/L)，8.2 μL ddH2O。PCR程序為二步法：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復性30 s，循環40次。采用2-ΔΔCT法計算基因表達量[15]。

2 結果與分析

2.1 CaPSY基因的鑒定

利用植物PSY基因HMM模型對辣椒2個全基因組數據進行搜索，通過Pfam網站進行鑒定，最終獲得6個CaPSY基因(表1)。CaPSY基因編碼的蛋白為303～432個氨基酸，其中CaPSY04編碼的蛋白最長有432個氨基酸，CaPSY03編碼的蛋白最短有303個氨基酸。相對分子量為33.61(CaPSY03)～48.44 ku(CaPSY04)。除CaPSY06基因編碼的蛋白等電點是5.59，為酸性蛋白，其余的等電點均大于7，為堿性蛋白。

2.2 CaPSY基因的結構分析

為了解CaPSY基因結構進化情況，將PSY基因的核苷酸序列與相應的基因組序列校正后確定內含子/外顯子的結構圖(圖1)。結果表明，CaPSY基因中除了CaPSY03基因沒有內含子，其他基因內含子的數量為5～12個。CaPSY02的內含子最多，有12個，其次是CaPSY06，有9個內含子，CaPSY04和CaPSY05均含有5個內含子，有相似的內含子/外顯子結構模式。

2.3 CaPSY基因的序列分析

為了明確CaPSY基因的序列特征，采用Clustal X和DNAMAN 6.0軟件對辣椒6個CaPSY基因的氨基酸序列進行多重序列比對。研究結果表明，所有的辣椒CaPSY基因都含有1個保守的反式-異平基-二磷酸合成酶結構域，存在4個保守的天冬氨酸殘基(圖2)，比Marchler-Bauer等的研究[16]多了2個天冬氨酸富集區，與前人的研究結果趨于一致。根據氨基酸序列相似性比對結果(表2)可知，CaPSY01、CaPSY04和CaPSY05基因的氨基酸序列相似性最高，其中CaPSY01與CaPSY04的相似性為59.7%，CaPSY01與CaPSY05的相似性為60.1%，而CaPSY04與CaPSY05的相似性高達85.3%，其次CaPSY02與CaPSY06的相似性為68.6%，CaPSY03與其他5個PSY基因的氨基酸相似性僅為8.1%～16.5%。

表2 CaPSY基因的氨基酸序列相似性

2.4 CaPSY基因家族的系統發育和保守基序分析

Tran等認為，部分藻類還保留PSYⅠ和PSYⅡ 2個家族，但高等植物只有PSYⅠ家族[17]。利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法構建進化樹，Bootstrap設為1 000次重復，去掉Bootstrap支持率低于60%的節點。結果表明，植物PSY氨基酸分成重要的2類：CladeⅠ和CladeⅡ，基本與PSY分類學上的結論[18-20]相符，同時也表明PSY的同源性與物種的親緣關系相關，如茄科的辣椒、馬鈴薯、茄子和番茄PSY聚在一起，藻類的團藻和微胞藻聚在一起，說明進化發生比較近。水稻、高粱和二穗短柄草聚在一起，表明PSY旁系同源基因的分化早于禾本科植物的種屬演化[21]，而且與其作用部位功能分化相關[22]。同個植物不同PSY之間的親緣關系有相近的，如CladeⅠ中辣椒CaPSY01、CaPSY04、CaPSY05聚為一支(CladeⅠa)，表明他們具有較高的保守性，其中CaPSY04和CaPSY05聚在一起，說明親緣關系較近，CaPSY02和CaPSY06聚為一支(CladeⅠb)，說明它們進化發生比較近。也有親緣關系較遠的，如辣椒CaPSY03單獨聚在CladeⅡ中最外圍，與其他辣椒PSY親緣關系較遠，可能也預示著基因不同的功能(圖3)。

為了研究辣椒CaPSY基因之間結構的多樣性，利用MEME在線工具對鑒定的6個CaPSY基因序列進行保守基序鑒定，結果見圖4。在辣椒中鑒定到8個保守基序，長度依次為41、50、50、41、40、50、50、50(表3)。CaPSY01、CaPSY04和CaPSY05編碼的蛋白均含有相同的5個保守基序(motif1+motif2+motif3+motif4+motif5)，CaPSY04和CaPSY05在進化分析中遺傳距離較近，并且它們編碼的蛋白保守基序分布也很相似，說明這2個基因親緣關系較近。CaPSY02編碼的蛋白含有5個保守基序(motif1+motif2+motif6+motif7+motif8)，CaPSY06編碼的蛋白含有3個保守基序(motif6+motif7+motif8)，基序motif6、motif7和motif8是CaPSY02和CaPSY06編碼的蛋白特有的基序，CaPSY03編碼的蛋白僅含有1個motif2保守基序，與其他CaPSY基因的進化關系較遠，這與進化分析的結果相一致。

表3 辣椒CaPSY基因的保守基序

2.5 CaPSY基因家族的染色體定位

根據鑒定得到的PSY基因的染色體位置信息進行染色體定位，如圖5所示，6個CaPSY基因分布在辣椒12條染色體中的4條染色體上，其中CaPSY01、CaPSY02和CaPSY03位于1號染色體上，CaPSY04、CaPSY05、CaPSY06分別位于2號、4號和10號染色體。在線(http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus)分析CaPSY基因的重復特征，未發現串聯重復情況。

2.6 CaPSY基因家族的表達特性分析

已有研究表明，在黃龍膽中至少有2 個PSY基因，PSYⅠ基因在花中特異性表達[23]，蘋果中有4個PSY基因，并且在不同的時期和組織中它們的表達量也不同[24]。為了更好地了解辣椒中6個CaPSY基因的特性，筆者研究了CaPSY在辣椒不同組織器官(根、莖、葉、花、嫩果、成熟青果、轉色果、成熟紅果)中的表達模式。設計了特異引物，在保守區域的外圍通過RT-PCR進行擴增。CaPSY基因特異引物由Prime 5軟件設計，以UBI作為內參檢測基因(表4)。如圖6所示，6個CaPSY基因在辣椒根、莖、葉、花和果實組織器官中均有表達，說明基因為組成型表達，但表達量存在差異，整體表現為花中表達水平最高，其次是果實，根部和莖部的表達量比果實中低，而葉中表達量最低，其中葉片和莖部器官中起主要調控作用的是CaPSY04和CaPSY05；根中以CaPSY03和CaPSY04為主參與根部類胡蘿卜素的合成；花器官中除了CaPSY06表達量低以外，其余CaPSY基因表達量都很高；CaPSY03和CaPSY05在果實中隨著果實成熟度的增加表達量逐漸增加，在果實轉色期和紅果中的表達量最豐富，這與草莓的相關報道[25]相一致，推測辣椒紅果中類胡蘿卜素的合成主要由CaPSY03和CaPSY05這2個基因調控，而CaPSY04和CaPSY06則表現出差異，表達量開始隨果實成熟度的增加而增加，但果實完全轉化成紅果時表達量卻降低，推測主要在果實轉色期起調控作用。

表4 辣椒CaPSY基因擴增引物序列

3 討論與結論

許多研究表明，辣椒成熟果實顏色的差異主要是由于類胡蘿卜素成分的變化，在植物體中已鑒定出許多酶和基因與類胡蘿卜素的合成相關[26]，其中PSY被認為是首要的調控基因[27]，已有研究表明通過沉默PSY基因表達發現其與橙色果實相關[13]。本研究基于已知的2個辣椒全基因組數據庫鑒定出的6個CaPSY基因，相較于其他作物如番茄、木薯、玉米中鑒定的3個PSY基因而言，辣椒CaPSY基因編碼的相對數量較高。

辣椒CaPSY編碼蛋白屬于全反式-異平基-二磷酸合成酶超家族(Trans_IPPS)，它包括4個天冬氨酸富集區域，比Marchler-Bauer等的研究結果[16]多了2個天冬氨酸富集區域，整體相一致。6個CaPSY基因定位在辣椒的4條染色體上，未發現串聯重復情況。系統進化樹分析結果表明，PSY的同源性與物種的親緣關系相關，6個辣椒CaPSY基因與茄科中的其他辣椒、番茄、馬鈴薯和茄子聚合度較高，但同一植物的不同PSY基因之間也會表現出親緣關系的遠近，如本研究中辣椒6個CaPSY聚為2類，其中CaPSY04和CaPSY05的親緣關系最近，CaPSY03與其他CaPSY的系統進化關系最遠，與基因的保守基序分析和氨基酸序列相似性分析結果相一致，預示著家族中每個基因具有不同的功能。

研究基因在組織和器官中的特定表達可以更準確地了解其在組織中的功能作用[28-29]。本研究鑒定出的6個辣椒CaPSY基因在根、莖、葉、花和果實中均有表達，說明基因為組成型表達，但表達量存在差異，呈現出組織特異性的功能分化，這與已報道的草莓PSY表達模式[25]相似，其中CaPSY03、CaPSY04和CaPSY05基因是辣椒各組織器官中調控類胡蘿卜素的主要基因，在成熟紅果中CaPSY03和CaPSY05的表達量最高，推測辣椒紅果中類胡蘿卜素的合成主要由這2個基因調控，這為研究新的分子靶標創制辣椒不同果色資源提供了理論依據。本研究探討的辣椒CaPSY基因家族的特性，為CaPSY基因功能機制的研究提供了基礎。