綠豆遺傳連鎖圖譜加密及生育期相關性狀的QTL定位

蔡德寶， 丁冬會， 馬 樂， 楊樹瓊， 孫新穎， 陳吉寶

(南陽師范學院/南水北調中線水源區水安全河南省協同創新中心，河南南陽 473061)

綠豆(Vignaradiata)是豆科(Leguminosae)菜豆族(Phaseoleae)豇豆屬(Vigna)植物中的一個栽培種，因其相對耐旱性強、具有固氮作用以及較短的生育期等特性而廣受歡迎，是豆類植物中重要的作物[1-2]。生育期是作物高產育種中極為重要的指標，它不僅決定了品種的種植地區與季節適應性，而且與抗逆性、品質以及產量密切相關[3-7]。綠豆屬于短日照作物，其生育期相關性狀主要包括始花期、開花期、始熟期、成熟期等，這些性狀屬于數量性狀，受多基因控制，遺傳力高且遺傳穩定性強，在分離群體中呈連續分布，可以通過數量性狀位點(quantitative trait locus，簡稱QTL)定位和圖位克隆的方法獲得這些基因[8-10]。

獲得一張高質量的遺傳圖譜是基因定位、圖位克隆乃至基因組結構與功能研究的基礎[11]，在綠豆中，葉衛軍等利用RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP 等分子標記和F2群體、回交群體、重組自交系群體(recombinant inbreed line，簡稱RIL)等作圖群體構建了至少20張遺傳圖譜[12]。在綠豆轉綠組和基因組數據公布之前，可用的分子標記十分有限，前人所繪制的綠豆遺傳連鎖圖譜主要基于栽培綠豆和野生綠豆雜交形成的群體，其主要原因是利用野生綠豆和栽培綠豆的種間雜交更容易篩選到多態性分子標記[13]。Kang等公布的首張綠豆基因組序列草圖和大量SSR分子標記[1]，為利用2個栽培綠豆品種雜交構建群體繪制高質量的遺傳連鎖圖譜提供前提[13-14]。近年來，綠豆生育期相關性狀的QTL定位也取得一定進展。梅麗等用RIL群體在廣西壯族自治區和北京2個生境下進行綠豆生育期相關性狀的QTL定位[7]，共鑒定出了4個與開花期相關的基因位點，貢獻率在4.95%～34.53%之間；共鑒定了4個成熟期QTL，分布LG2、LG9上。Isemura等發現了4個與初花期緊密相關的QTL，其中位于LG2上的QTL貢獻率最大[15]。Kajonphol等鑒定了6個始熟期QTL位點，位于第2、4、6、7、9、11連鎖群上[16]。Somta等在雨季和旱季2種環境下對綠豆開花期進行QTL定位，共檢測到7個QTL，其中位于LG2A連鎖群上的2個標記區間在2種環境下均檢測到開花期QTL[17]。

盡管對綠豆的生育期相關性狀已有大量研究，鑒定出了一些生育期相關QTL位點，但是還存在以下問題需要解決：(1)這些研究限于綠豆開花期、成熟期等生殖生長階段，缺乏對綠豆營養生長階段的研究，更沒有對各生育期相關性狀進行系統分析；(2)還有新的生育期相關性狀位點沒有完全分離出來，需要繼續發掘；(3)盡管目前研究者繪制了多張綠豆遺傳連鎖圖譜，但由于標記數量少，分辨率低，不能滿足基因圖位克隆的條件。本研究以RIL群體為材料，在自然條件下通過3年的田間表型評價，研究綠豆生育期相關性狀的遺傳特征，通過對Liu等構建的圖譜[14]加密，整合1張高密度綠豆遺傳連鎖圖譜，應用新圖譜定位綠豆生育期相關性狀QTL，為綠豆生育期研究提供標記信息，推動綠豆熟性分子育種的發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用綠豆RIL群體由中國農業科學院作物科學研究所食用豆課題組提供，該群體以晚熟材料鸚哥綠和早熟材料VC2917為父母本構建而成，包含261個株系[14，18]，目前已經繁殖至F9代。

1.2 田間試驗設計與數據分析

大田試驗于2018—2020年春季在河南省南陽師范學院農田進行，于每年4月下旬播種，完熟后收獲。綠豆生長期間按照正常田間管理措施進行，于分枝形成前中耕1次，并起壟培土，整個生長期間不人為澆水。試驗采用完全隨機區組設計，重復3次。

出苗期(GD)、三葉期(TLD)、分枝期(BS)、始花期(FFD)、始花期-分枝期(FFD-BS)、開花期(FD)、開花期-分枝期(FD-BS)、成熟期(MD)嚴格按照《綠豆種質資源描述規范和數據標準》進行調查統計[8]。

參照陳吉寶的方法[19]計算2018、2019、2020年3個年份8個性狀的表型數據的BLUE值。用SPSS 24.0進行描述性統計分析、方差分析(ANOVA)和相關性分析，并計算廣義遺傳率。

1.3 SSR分子標記的篩選和基因分型

本研究總計篩選SSR引物275對，其中250對為Kang等開發[1]，下載自NCBI網站綠豆基因組數據庫(GenBank/EMBL/DDBJ數據代碼JJMO00000000)，前綴為“Vr”；25對為Liu等從綠豆近源種小豆中篩選[14]，前綴為“CEDG”。

取綠豆RIL群體苗期鮮嫩葉片，用研缽在液氮環境中研磨成粉狀，綠豆RIL群體單株及親本基因組DNA采用試劑盒(EasyPure? Plant Genomic DNA Kit)提取；PCR擴增采用10 μL反應體系：酶(2×EasyTaq? PCR SuperMix for PAGE+dye)5 μL，引物0.5 μL (10 μmol/L)，模板1 μL(50 ng/μL)，ddH2O 3.5 μL。PCR反應程序及銀染檢測參考王建花等的方法[11]。

1.4 遺傳連鎖圖譜的加密

選擇2個親本間具有明顯多態性的SSR標記進行RIL群體的基因分型。讀板時母本帶型記作“A”，父本帶型記作“B”，雜合帶型記作“H”，空缺或其他帶型記作“X”。利用卡平方測驗分析每個標記在0.05、0.01和0.001水平上是否符合1 ∶1的分離規律，用于推斷標記偏分離情況。

利用QTL IciMaping V4.0軟件[20]加密綠豆遺傳連鎖圖譜，加密前遺傳連鎖圖譜由Liu等構建[14]。加密參照軟件提供的Sampledata進行數據格式化，用Grouping命令對所有標記進行分組，比較不同LOD值下的分組情況，選擇最優分組；運算法則選用“nnTwoOpt”，其他參數采用軟件默認值。

1.5 生育期性狀的QTL分析

本研究基于Liu等構建的圖譜[14]，利用加密后的圖譜進行QTL定位，采用QTL IciMapping V4.0軟件改進復合區間作圖法定位[20]，Permutation次數設置為1 000次，LOD值以大于等于2.5為標準。

2 結果與分析

2.1 綠豆生育期性狀遺傳分析

從表1可以看出，RIL群體內分枝期、始花-分枝期、開花期、成熟期的最大值和最小值均分別高于親本最大值和小于親本最小值，群體內除開花期、開花-分枝、成熟期外，其余各性狀均值均小于雙親均值。各性狀變異系數為5.01%～28.81%，其中變異系數最小的是分枝期，始花期-分枝期變異系數最大，以上結果說明各性狀在群體個體之間均得到較好的分離。8個性狀的遺傳力在42.24%～82.38%之間，其中三葉期、始花期、始花-分枝期和成熟期的遺傳力較高，均大于70%；分枝期、開花-分枝期的遺傳力均小于50%，表明二者的遺傳力較低。除出苗期、三葉期外，其余性狀偏度絕對值均小于或近似等于1，說明這些性狀近似符合正態分布；除分枝期和開花-分枝期外，其余性狀偏度均大于0，分枝期和開花-分枝期表型數據分布向右偏，其他性狀表型數據分布向左偏，其中出苗期的偏度為1.6，呈明顯向左偏。除始花期、始花-分枝外，其他性狀峰度的絕對值均大于0.5；始花期、始花-分枝的峰度小于0，表明這2個性狀表型分布不太集中。從圖1可以看出，群體各性狀值均呈連續分布，說明這些性狀適合QTL分析。

表1 RIL群體各生育期性狀的分布特征

2.2 綠豆生育期性狀相關性分析

依據8個性狀的BLUE數據進行各生育期性狀之間的相關分析，結果(表2)表明，出苗期與分枝期、始花期、開花-分枝間隔期，三葉期與成熟期以及分枝期與成熟期均呈顯著正相關；三葉期與分枝期，分枝期與開花-分枝間隔期，始花期與始花-分枝間隔期、開花期、開花-分枝間隔期、成熟期，始花-分枝間隔期與開花期、開花-分枝間隔期、成熟期，開花期與開花-分枝間隔期、成熟期，開花-分枝間隔期與成熟期均呈極顯著正相關；其中始花期與始花-分枝間隔期相關性最強(0.861)，表明始花期在決定始花-分枝間隔期起關鍵性作用，其次為開花期與成熟期(0.737)；分枝期與始花-分枝間隔期呈極顯著負相關(-0.302)，表明分枝期對始花-分枝間隔期起負作用。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構建

共得到親本間具有多態性且在RIL群體中帶型清晰的引物20對，多態性比率7.2%(圖 2)。這些分子標記連同Liu等所使用的313個標記[14]，通過QTL IciMaping V4.0作圖[20]，得到1張新的綠豆遺傳圖譜，加密后圖譜的各項特征較原圖譜均有所改變(圖3)。

表2 綠豆生育期相關性狀間的相關性分析

Liu 等的原圖譜由11個連鎖群組成，包含313個分子標記，總長為1 010.18 cM[14]。新圖譜包含11個連鎖群，333個標記位點，圖譜總長為 1 417.29 cM。原圖譜各連鎖群標記數為19～74個，平均28.45個，其中標記最少的是LG2、LG7，各連鎖群平均標記數為19個，LG4標記數最多，包含74個標記。各標記間距離在 2.14～4.29 cM之間，平均3.37 cM，加密后各連鎖群密度為 2.14～6.24 cM，平均密度為4.26 cM。新圖譜標記間平均距離有所增大，是由于新圖譜LG1、LG2連鎖群中存在2個大于40 cM的空隙，整合后圖譜有所延長，對綠豆基因組的覆蓋率也極大增加。除LG4、LG9未新加標記外，其余連鎖群的長度都發生了較大改變，如LG1連鎖群新增標記4個，長度由59.74 cM 延長為 128.07 cM；LG10連鎖群新增標記3個，長度由82.42 cM 延長到116.63 cM；LG5連鎖群新增2個標記，長度由65.46 cM 延長到91.96 cM。

標記位置隨著新標記的加入而有所變動。如第1連鎖群上MUS275～HAAS_VR_1620這9個標記、第6連鎖群HAAS_VR_2489～CEDG-144這9個標記在新標記加入后，標記間的方向、距離均有所改變，同時相鄰標記間的位置也有所改變，但未發生連鎖水平上的改變。新建圖譜333個標記中，偏分離標記數72個(21.62%，P<0.05)，各連鎖群偏分離標記數在1(LG6、LG10)～17(LG1)之間(表3)。新加標記中嚴重偏分離(P<0.001)的標記主要位于LG1上，且偏分離的標記主要偏向于父本，與Liu等的圖譜[14]類似。

2.4 生育期相關性狀的 QTL分析

本研究對綠豆8個生育期相關性狀的BLUE數據進行QTL分析，共檢測到15個QTL位點，成熟期檢測到4個QTL位點，出苗期檢測到3個QTL位點，三葉期、開花期各檢測到2個QTL位點，分枝期、始花期、始花-分枝間隔期以及開花-分枝間隔期均檢測到1個QTL位點。

共檢測到3個出苗期(GD)QTL位點。其中第1連鎖群(LG1)的MUS275～CEDG-150、第2連鎖群(LG2)的Vr11-473～Mchr11-45以及第6連鎖群(LG6)的MUS118～MUS35標記之間檢測各到1個QTL位點(GD1a、GD2a、GD6a)，貢獻率分別為59.24%、63.85%、6.97%，其中GD1a、GD2a位點對出苗期有較大貢獻，是決定出苗期的大效應位點。3個QTL位點加性效應均為負值，平均加性效應為-0.51，平均可使出苗期減少0.51 d。

表3 圖譜加密前后定位的QTL比較

共檢測到2個三葉期(TLD)QTL位點。其中LG1的MUS275～CEDG-150、LG6的MUS168～Mchr7-23之間各檢測到1個QTL(TLD1a、TLD6a)，貢獻率分別為26.76%、10.29%，表明前者是決定三葉期的大效應位點。TLD1a加性效應為負，可使三葉期減少1.86 d，TLD6a加性效應為正，可使三葉期增加0.64 d。

檢測到1個分枝期(BS)QTL位點(BS9a)，位于第9連鎖群的Mchr10-9～Mchr5-37標記之間，該位點貢獻率為5.95%，可能屬于微效基因。該位點加性效應為負，說明該位點可縮短分枝期。

檢測到1個始花期(FFD)QTL位點(FFD2a)，位于第 2 連鎖群的MUS171～MUS617標記之間，該位點貢獻率較大(11.61%)，說明該位點對FFD的貢獻較大，可能屬于大效應位點。該位點加性效應為-0.96，說明該位點可使FFD縮短0.96 d。

檢測到1個始花-分枝間隔期(FFD-BS)QTL位點(FFD-BS2a)，位于第2連鎖群的MUS171～MUS617標記之間，該位點貢獻率為10.44%，說明該位點對FFD-BS的貢獻較大。位點加性效應為負，說明該位點可縮短FFD-BS。

共檢測到2個開花期(FD)QTL位點。其中LG1的MUS275～CEDG-150、LG2的Vr11-473～Mchr11-45標記之間各檢測到1個QTL位點(FD1a、FD2a)，單個位點貢獻率分別為36.95%、51.30%，說明二者對FD的貢獻均較大，均屬于大效應位點。2個位點加性效應均為負，平均為 -3.56，平均可使FD減少3.56 d。

檢測到1個開花-分枝間隔期(FD-BS)QTL位點(FD-BS11a)，位于第11連鎖群的Mchr10-49～HAAS_VR_1519標記之間，該位點貢獻率為11.09%，說明該位點對FD-BS的貢獻較大。該位點加性效應為0.62，說明該位點可使FD-BS增加0.62 d。

共檢測到4個成熟期(MD)QTLs 位點。分別為位于第1連鎖群MUS275～CEDG-150與第2連鎖群Vr11-473～Mchr11-45標記之間的MD1a、MD2a，以及LG11 Mchr10-1～Mchr10-5與Mchr10-27～Mchr10-30標記之間的MD11a、MD11b。MD1a、MD2a均屬于大效應位點(貢獻率分別為37.77%、44.76%)，且加性效應均為負，累計可使MD減少8.95 d。MD11a、MD11b可能屬于微效基因(貢獻率分別為6.19%、8.36%)，前者加性效應為負，后者加性效應為正(圖4、表4)。

3 討論與結論

3.1 綠豆生育期性狀統計學性分析

生育期是豆類作物產量形成的重要因素[21]，研究綠豆生育期相關性狀的遺傳規律是了解其產量形成機制的重要途徑之一。綠豆生育期相關性狀主要包括出苗期、三葉期、分枝期、始花期、開花期、始熟期、成熟期[8]。本研究中，出苗期、三葉期、始花-分枝間隔期的變異系數均大于10%，最高達28.81%，開花期、成熟期變異系數均小于10%，說明營養生長前期的遺傳受環境影響大于生殖生長期，與馬樂等的研究結果[22，6]類似。Sompong等研究發現，綠豆成熟期與始花期呈極顯著正相關[23，16]。梅麗研究表明， 與生育期的關聯度由高到低排序為開花期、始花期、出苗期[6]。綠豆開花期和成熟期遺傳力高且遺傳穩定性強，Yimram等對340個綠豆種質材料的分析表明，開花期、成熟期廣義遺傳力分別為0.75、0.71[24]。Kajonphol等研究發現，綠豆始花期、始熟期遺傳力分別為0.89、0.91[16]。馬樂等研究表明，綠豆開花期和成熟期的廣義遺傳力在0.95以上[18]。本研究中綠豆始花期、開花期、成熟期遺傳力均較高，分別為0.77、0.59、0.74。以上結果說明，始花期、開花期在影響綠豆生育期中扮演重要角色，育種實踐中關注始花期、開花期對選育不同生育期長短的綠豆新品種更有效，開花期、成熟期遺傳力高，有利于相關基因的定位和圖位克隆[25，26]。

表4 綠豆生育期相關性狀的QTL

3.2 遺傳連鎖圖譜的構建

構建高質量的遺傳連鎖圖譜是基因定位前提條件之一[27]。前人所繪制的綠豆遺傳連鎖圖譜主要基于栽培綠豆和野生綠豆雜交形成的群體，主要原因是栽培綠豆與栽培綠豆的種間雜交很難篩選出多態性標記[13]。Chankaew 等利用綠豆的433個SSR標記對2種栽培綠豆KPS1和V4718之間進行多態性進行評估，結果發現只有27個(8.85%) SSR標記在親本之間存在多態性[2]；Liu等使用Isemura等的JP211874×JP229096(野生綠豆×栽培綠豆)綠豆群體中430個表現出多態性SSR標記，只有24個顯示出多態性[14-15]。本研究應用275對SSR引物對親本VC2917和鸚哥綠進行篩選，親本間共得到多態性引物20對，親本間多態性為7.2%，使得本研究設計的多態性SSR標記具有價值。

整合后遺傳連鎖圖與Liu等的原圖譜[14]基本一致，但也有一些標記位置隨著連鎖圖譜整合發生變動，主要變動為第1、第6連鎖群上的位置發生顛倒。趙丹等整合綠豆遺傳連鎖圖譜時也發生類似狀況，認為這可能是因標記偏分離現象的影響[28]。本研究整合的綠豆遺傳連鎖圖譜中有72個偏分離標記，偏分離比率為21.75%，低于趙丹等構建的綠豆遺傳連鎖圖譜[28-30]，高于Isemura等構建的綠豆遺傳連鎖圖譜[15]。這可能是因為本研究所用群體為栽培綠豆×栽培綠豆構建的RIL群體，避免了野生親本攜帶的不利位點，但與回交群體相比，RIL群體偏分離比率一般更高，主要原因是RIL群體構建時人為抽樣的偏差以及多代的自然選擇[14，28]。

3.3 生育期相關性狀的 QTL分析

本研究通過1點3年大田試驗，對8個生育期相關性狀的BLUE數據進行QTL定位，各性狀均檢測到QTL位點。數量性狀的表達極易受環境的影響，在生長環境不同時定位的結果可能不同[7]，本研究與馬樂使用相同群體在同一試驗地點不同年份進行QTL定位，將三葉期QTL定位在LG6(MUS168～Mchr7-23)[22]。本研究在該區間外檢測1個QTL，位于LG2的MUS275～CEDG-150標記之間，同時也說明該性狀可能為由位于不同染色體的多個QTL調控。大效應QTL一般是在不同生境下均可以檢測到的穩定QTL，存在相關基因的概率更大，是實現圖位克隆的關鍵區域[31-32]與梅麗研究結果[6]類似，本研究將出苗期定位在第1、第2連鎖群；本研究將開花期QTL定位在LG1、LG2，與Isemura等(LG2、LG4、LG6 和 LG11)[15]、梅麗等(LG2、LG9、和 LG12)[7]及Somta等(LG2、LG4、LG5和LG6)[17]的研究結果類似，且大效應位點位于LG2，說明第2連鎖群上存在決定開花期性狀的關鍵基因；與Sompong等的研究結果[23]相比，本研究在LG2檢測到1個成熟期大效應QTL，與Isemura等類似[15-16]。上述大效應 QTL 可以為今后該性狀進一步研究提供借鑒，可為今后分子標記輔助選育新型早熟綠豆品種提供新的基因位點。

本試驗發現2個QTL富集區，第1連鎖群的MUS275～CEDG-150標記區間富集了開花期、成熟期2個性狀的QTL位點，第2連鎖群的MUS171～MUS617標記區間檢測到控制始花期、始花-分枝間隔期的QTL，這種QTL的富集現象在梅麗等的研究中也有報道[6，14，19]。Guan等認為，QTL簇(QTL cluster)或QTL富集區是一因多效或者多個基因緊密連鎖的結果[33]。本試驗還發現，在QTL成束的區域，第2連鎖群Vr11-473～Mchr11-45區間的不同位點檢測到控制出苗期、開花期、成熟期關鍵性狀QTL位點，Tuberosa 等認為，控制同一性狀的QTL可能分布于染色體上的一個集中區域，而不是隨機分布[34]。然而目前所用圖譜依然無法滿足圖位克隆的需要，今后有必要借助全基因組關聯分析(genome-wide association study)技術，有針對性地進行精細定位。在此基礎上，開發與這些生育期性狀密切相關的分子標記，通過回交育種與分子標記輔助選擇相結合的方法，選育出新的綠豆早熟品種，為綠豆育種創造優異新材料。