HPLC-MS/MS法用于達沙替尼血藥濃度監測*

程芳，李強，王靜林，張玉 ，黎緯明，曾芳

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥學部，武漢 430022；2.湖北省重大疾病精準用藥醫學研究中心，武漢 430022；3.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院血液科，武漢 430022)

達沙替尼是靶向于BCR-ABL的第2代酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，臨床主要用于治療對于伊馬替尼耐藥或不耐受的費城染色體陽性的慢性髓細胞白血病(CML)慢性期、加速期和急變期的成年患者[1]，常見的不良反應包括體液潴留(胸腔積液)、皮疹、骨骼疼痛和腹瀉等[2]。

達沙替尼在連續給藥28 d后達到穩態，達沙替尼峰濃度(服藥后2 h的血藥濃度，Cmax)與其藥-時曲線下面積(AUC)密切相關，可用于預測患者療效[3]。前期研究常選擇測定谷濃度(C0)和Cmax來預測達沙替尼的治療效果[4]。達沙替尼血藥濃度具有明顯的個體內和個體間的差異，且與臨床療效密切相關[5]。研究表明服用同等劑量(100 mg，qd) 達沙替尼的患者中C0和Cmax的差異較大，在中國人群中達沙替尼的體內暴露量和半衰期等明顯高于服用同等劑量的歐美人群[6-7]，提示達沙替尼的藥動學過程可能與基因和種族等因素密切相關。同時食物以及合并用藥也會影響達沙替尼的血藥濃度[8]。因此服用達沙替尼治療的患者，建議定期進行藥物濃度監測，對提高臨床療效和降低其不良反應具有重要意義。

根據歐洲白血病網的建議，應在接受TKI治療3，6和12個月后評估CML患者的臨床治療效果。對于在3個月內未獲得滿意療效的患者，建議考慮監測TKI血藥濃度。在針對CML患者的TKI治療中，治療藥物監測是劑量優化方法，以期獲得更快，更有效的臨床治療新策略。本研究旨在運用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)，建立一種穩定性好、通用性強、靈敏度高、檢測下限低、能夠滿足臨床患者血漿中達沙替尼濃度的檢測方法，為后續血藥濃度與臨床療效的關系、藥動學及體內外代謝相關研究提供方法學支撐。

1 儀器與試藥

1.1儀器 三重四極桿質譜儀(型號：API4000+，美國AB SCIEX公司)；超高壓液相色譜儀(型號：ACQuity H，美國Waters 公司)；低溫高速離心機(型號：5804R，德國Eppendorf公司)；渦旋混合器(型號：Vortex-5，海門市其林貝爾儀器廠)；十萬分之一電子分析天平(型號：AB135-S，瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2試劑 達沙替尼標準品(批號：19-SEP-19-00，含量：99.4%，加拿大TRC公司)；伊馬替尼-D8內標(批號：I267987，含量：98.4%，加拿大TRC公司)；甲酸銨(批號：173132，含量：99%，美國Sigma公司)；乙腈、甲醇溶液(色譜級，美國TEDIA公司)。

2 方法與結果

2.1方法

2.1.1液相色譜條件 色譜柱為Luna?C18柱(2.0 mm×20 mm，3 μm)；流動相：A相為含0.1%甲酸的10 mmol·L-1甲酸銨緩沖液，B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫方式，洗脫程序見表1；流速：0.6 mL·min-1；柱溫35 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序 Tab.1 The determination gradient elution conditions

2.1.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；干燥溫度：500 ℃；噴霧電壓：5500 V；離子源氣體1(N1)與氣體2(N2)壓力均為55 psi；氣簾氣壓力為25 psi；掃描方式為多反應監測(MRM)，待測物及內標的其他檢測參數見表2。

表2 待測物及內標的質譜檢測參數 Tab.2 Mass spectrometric parameters of analytes and internal standards

2.1.3儲備液及工作液的配制 精密稱取達沙替尼10 mg，用甲醇-水(V/V=1：1)溶解達沙替尼，稱取伊馬替尼-D81 mg，用純甲醇溶解伊馬替尼-D8，然后分別定容至10 mL，搖勻，即得到1 mg·mL-1達沙替尼標準品儲存液，以及0.1 mg·mL-1伊馬替尼-D8內標儲存液，4 ℃避光保存。

取達沙替尼對照品儲存液適量，甲醇-水(V/V=1：1)稀釋至相應濃度(10，5，2.5，1，0.5，0.1，0.05，0.01 μg·mL-1) ，質控低濃度(0.025 μg·mL-1)、中(1.0 μg·mL-1) 、高(8.0 μg·mL-1) 。

2.1.4標準曲線及質控血漿樣品的制備 180 μL空白血漿中分別加入20 μL達沙替尼工作液，配制標準曲線和質控對照品，標準曲線濃度范圍為1，5，10，50，100，250，500，1000 ng·mL-1；質控對照品低濃度(2.5 ng·mL-1) 、中濃度(100 ng·mL-1) 、高濃度(800 ng·mL-1)，定量下限(1 ng·mL-1)。

2.1.5樣品前處理 精密吸取血漿樣品180 μL，依次加入內標儲存液20 μL，甲醇800 μL除蛋白，渦旋混合均勻，在10 625×g相對離心力下離心10 min，取上清液上樣分析，進樣量10 μL。

2.1.6臨床應用 收集華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院2020年5月—2022年1月服用達沙替尼治療的CML患者血漿標本共30例。該研究已通過華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院倫理委員會的審批([2021]倫理字(0784))，納入研究的患者均自愿簽署知情同意書。所有患者接受口服達沙替尼治療，每次100 mg，一天一次。達沙替尼在連續治療28 d后血藥濃度達穩態，給藥2 h后血藥濃度達到峰值。服用達沙替尼的患者需要同時測定谷濃度和峰濃度用來評估療效與不良反應。患者服用達沙替尼達穩態后，在下一次服藥前空腹采血2～5 mL，此時的濃度為谷濃度；服藥2 h后再一次采血2～5 mL，這時的濃度為峰濃度。血樣置于乙二胺四醋酸(EDTA)抗凝管中，離心取上清液進行HPLC-MS/MS 法檢測。

2.2結果

2.2.1方法專屬性考察 達沙替尼和伊馬替尼-D8的保留時間分別為1.99和1.93 min，空白血漿不干擾達沙替尼和內標物質的測定。色譜圖見圖1。

A.空白血漿；B.定量下限的標準血漿樣品；C.服用達沙替尼患者的穩態谷濃度血漿樣本。圖1 達沙替尼典型質譜圖 A.blank plasma；B.standard plasma at the limit of quantitation；C.plasma sample at steady state of patients receiving dasatinib.Fig.1 Typical mass spectrum of nilotinib and dasatinib

2.2.2標準曲線與線性范圍 取達沙替尼的標準曲線混合血漿樣品上樣，達沙替尼與內標的峰面積比(Y)分別對血漿中的濃度進行加權線性回歸，權重系數為1/X2，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：Y=0.000 561X+0.000 174，r2=0.997 4，結果表明達沙替尼血藥濃度在1～1000 ng·mL-1的范圍內線性關系良好，定量下限為1 ng·mL-1。

2.2.3準確度和精密度 取達沙替尼定量下限(1 ng·mL-1) 、低(2.5 ng·mL-1) 、中(100 ng·mL-1) 、高(800 ng·mL-1)質控4個濃度的血漿樣品，每一樣品配制6份，同一天內上樣，分別計算準確度，日內精密度，連續測定3 d，計算日間精密度。精密度以相對標準偏差(relative standard deviation，RSD) 表示，準確度以樣品測定均值對理論值的相對偏差(RE)表示。結果見表3。

表3 達沙替尼測定方法的準確度與精密度 Tab.3 Accuracy and precision of determination for dasatinib

2.2.4提取回收率 分別配制低、中、高質控樣品各6份，上樣分析記錄峰面積為A1，另外取6份空白血漿，甲醇提取后分別再加入達沙替尼以及內標質控對照品，上樣分析記錄峰面積為A2，提取回收率(%)= A1/A2× 100%。結果見表4。

表4 達沙替尼提取回收率與基質效應 Tab.4 Extraction recovery and matrix effect of dasatinib

2.2.5基質效應 取6例不同患者的空白血漿各180 μL，分別加入適量的達沙替尼制備低、中、高3個濃度的樣品，上樣分析記錄峰面積為A3。取180 μL的超純水，相同處理后直接進樣，峰面積為A4。基質效應= A3/A4×100%。結果表明血漿對達沙替尼的測定沒有干擾影響，結果見表4。

2.2.6殘留效應 本實驗進一步考察了進樣高濃度樣品后的殘留問題，計算進樣高濃度點后的殘留峰面積與標準曲線最低濃度點峰面積的比值。結果表明達沙替尼殘留為0.08%，殘留分析物不影響檢測的準確度和精密度。

2.2.7穩定性 本實驗考察了達沙替尼質控品在室溫放置24 h；-20 ℃凍融3次；以及4 ℃避光放置3 d的穩定性，結果見表5。結果表明該方法具有很好的穩定性。

表5 達沙替尼穩定性考察結果 Tab.5 Stability inspection results of dasatinib

2.2.8臨床應用 分別收集本院30例服用達沙替尼的CML患者進行峰濃度與谷濃度測定。達沙替尼谷濃度為4.75(0.85～35.8)ng·mL-1，峰濃度為168.8(75.3 ～583.6)ng·mL-1。由此可見，筆者在本實驗建立的HPLC-MS/MS 法能滿足臨床對達沙替尼血藥濃度檢測的需求。

3 討論

之前報道的達沙替尼血藥濃度測定方法普遍存在靈敏度低、樣本前處理復雜、樣本分析時間長等弊端，而且檢測下限過高，無法滿足臨床需求[9-10]。本研究結合國內外推薦的藥物有效治療窗，設置合理的濃度范圍，采用HPLC-MS/MS法檢測人血漿中達沙替尼的藥物濃度，前處理采用甲醇沉淀，高速離心的方法除蛋白，方法簡單，出峰時間短。由于結構相似，保留時間接近，該方法采用伊馬替尼-D8作為內標進行定量，提取回收率和基質效應試驗結果均說明伊馬替尼-D8可以最大限度避免基質效應。該方法檢測靈敏度高、檢測限低，可滿足臨床對于達沙替尼血藥濃度檢測的需求。

目前TKI類藥物濃度監測在臨床上仍處于起步階段，但現有證據表明，基于藥物動力學參數的劑量調整對大多數接受TKI治療的CML患者有益[11]。研究表明每日劑量為100 mg的患者C0和Cmax的變異系數(CV)值分別為26%和56%[12]，說明達沙替尼Cmax的個體間差異較大。CML患者主要的細胞遺傳學反應(CCyR)與達沙替尼平均穩態血漿濃度顯著相關[13]，胸腔積液發生率與達沙替尼C0顯著相關(危險比為1.22)[14]。對于達沙替尼，建議每天服用一次，維持較高的Cmax(≥50 ng·mL-1)可以獲得良好的臨床治療效果[15]，而較低的C0(<2.5 ng·mL-1)可以避免胸腔積液。本實驗結果發現服用達沙替尼的中國CML患者血藥濃度個體差異性大，結合部分患者的臨床療效也發現谷濃度較高的患者更易發生不良反應，但是需要擴大樣本量進一步深入研究。

本研究建立的達沙替尼血藥濃度檢測方法最大特點在于前處理操作簡便，采用同位素內標避免基質效應，檢測范圍合理，可滿足臨床大樣本檢測以及藥動學分析要求。本方法為后續進一步研究達沙替尼血藥濃度與臨床療效和不良反應的關系提供了很好的方法學支撐。