LC-MS/MS法測定苯磺酸氨氯地平膠囊中兩種潛在基因毒性雜質(zhì)的含量

孫朗，石明睿，熊志立

(1.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016；2.麗珠集團麗珠制藥廠，珠海 519045)

近年國內(nèi)仿制藥及一致性評價審評中日益重視雜質(zhì)譜的研究，特別是潛在基因毒性雜質(zhì)的評估[1-2]。苯磺酸氨氯地平膠囊臨床應用廣泛，是治療高血壓病的首選藥物之一[3]。由于苯磺酸在合成過程中可能引入苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯等基因毒性雜質(zhì)，目前國內(nèi)外對苯磺酸氨氯地平各劑型藥物基因毒性雜質(zhì)的報道多為配體苯磺酸所引入的苯磺酸酯類雜質(zhì)[4-5]。作者依據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心“關于公開征求4個ICH指導原則中文翻譯稿意見的通知”和“Q3C(R8)：雜質(zhì)：殘留溶劑的指導原則”，對該品種的起始物料、中間體、副反應及降解產(chǎn)物進行系統(tǒng)研究，篩選出2個分別具有氮雜環(huán)氮氧和酰化芳香氨警示結(jié)構(gòu)[6-8]的非苯磺酸酯類潛在基因毒性雜質(zhì)：氨氯地平氮氧化物和4-(2-(1，3-二氫 -二氧代異吲哚啉-2-基)乙氧基)-3-氧代丁酸乙酯(以下簡稱雜質(zhì)A和B，結(jié)構(gòu)見圖1)，并依據(jù)化合物的極性和結(jié)構(gòu)特點，結(jié)合所需控制的雜質(zhì)限度，開發(fā)靈敏度高、專屬性強的LC/MS方法[9-11]對其含量進行測定，為苯磺酸氨氯地平膠囊的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

圖1 苯磺酸氨氯地平中潛在基因毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu) Fig.1 Potential genotoxic impurities in amlodipine besylate

1 儀器與試藥

1.1儀器 Triple Quad 5500液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 AB Sciex公司)；SQP電子分析天平(美國賽多利斯科學儀器公司)；KH-500E超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器)；H1850離心機(湖南湘儀儀器實驗室開發(fā)公司)。

1.2試藥 氨氯地平氮氧化合物(Standardpharm公司，批號：1919336A-SL-01)、4-(2-(1，3-二氫 -二氧代異吲哚啉-2-基)乙氧基)-3-氧代丁酸乙酯(Standardpharm公司，批號：1819345A-SL-01)，苯磺酸氨氯地平膠囊(麗珠集團麗珠制藥廠，批號：V180901、V180902、V180903)，參比制劑苯磺酸氨氯地平膠囊(Pfizer SA公司，批號：B217802B)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；流速為 0.5 mL·min-1；柱溫為40 ℃；自動進樣器溫度5 ℃；進樣體積為2 μL；流動相A為5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，按以下條件(表1)進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫條件 Tab.1 Conditions of gradient elution

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式采集，多反應離子監(jiān)測模式(MRM)；雜質(zhì)A和B的定量離子對分別為 423.0/334.0和320.1/174.0；干燥氣離子源溫度為 600 ℃；干燥氣流速為 35.0 psi；霧化離子化電壓為 5500 V；霧化氣50 psi；輔助加熱氣50 psi；傳輸電壓為 85 V；碎裂電壓為 15 V；掃描范圍為m/z100～500，質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 雜質(zhì)A和B的質(zhì)譜圖 Fig.2 Mass spectrum of impurity A and B

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取雜質(zhì)A和B對照品適量，用乙腈稀釋成每毫升含雜質(zhì)A 22 ng·mL-1、雜質(zhì)B 22 ng·mL-1的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取苯磺酸氨氯地平膠囊內(nèi)容物適量(相當于苯磺酸氨氯地平5.0 mg)，置50 mL離心管中，精密加入溶劑乙腈25 mL，渦旋，超聲5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3空白溶液的制備 取乙腈濾過后即可。

2.3專屬性考察 取各個雜質(zhì)的對照品溶液、加標供試品溶液(100%濃度水平)及空白溶液，依法測定。得到的色譜圖表明：各雜質(zhì)對照品溶液及加標供試品溶液在同一位置顯示目標分子量峰，空白溶液無干擾，本方法專屬性良好，典型色譜圖見圖3。

圖3 雜質(zhì)對照品及樣品質(zhì)譜圖 Fig.3 Mass spectrum of impurities and sample

2.4定量限與檢測限考察 精密稱取各雜質(zhì)對照品適量，加乙腈配制成每毫升含雜質(zhì)A約4.5 ng·mL-1，雜質(zhì)B約4.3 ng·mL-1的溶液，作為定量限溶液，依法檢測6次。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測試結(jié)果信噪比約等于10；雜質(zhì)A和B連續(xù)6針定量限溶液中目標峰峰面積的RSD分別為2.0%和0.8%，本方法定量限能滿足需求。

精密量取定量限溶液2.5 mL，置于5 mL量瓶中，加乙腈定容，制成每毫升含雜質(zhì)A約2.3 ng·mL-1，雜質(zhì)B約2.2 ng·mL-1的溶液，作為檢測限溶液，依法檢測6次。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測試結(jié)果信噪比約等于3，本方法檢測限能滿足需求。

2.5線性關系考察 精密稱取雜質(zhì)A和B對照品各10.255和9.986 mg，分別置于100 mL量瓶，加乙腈溶解并定容至刻度。精密量取上述溶液各0.22 mL置于100 mL量瓶，加乙腈定容至刻度，制得含兩雜質(zhì)濃度分別為225.6和219.7 ng·mL-1的雜質(zhì)對照品儲備液(1000%限度濃度)。分別精密量取上述對照品儲備液0.2，0.5，1，1.5和2，0 mL置于10 mL量瓶，加乙腈定容至刻度，制得含雜質(zhì)A濃度為4.51，11.28，22.56，33.84，45.12 ng·mL-1；雜質(zhì)B濃度為4.39，10.98，21.97，32.95，43.93 ng·mL-1各共5個濃度水平的線性溶液。將上述溶液依次依法測定，結(jié)果見表2。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，可得雜質(zhì)A線性方程為Y=8.164×104X+70 146(r=0.990)；雜質(zhì)B線性方程為Y=2.362×105X+35 610(r=1.000)。結(jié)果表明：雜質(zhì)A在4.51～45.12 ng·mL-1，雜質(zhì)B在4.39～43.93 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關系良好。

表2 線性考察實驗結(jié)果 Tab.2 Linearity of two kinds of impurities

2.6精密度實驗 取“2.5”項下各雜質(zhì)100%濃度水平溶液(含雜質(zhì)A和B的濃度分別為22.56和21.97 ng·mL-1)，依法連續(xù)測定6次，分別計算雜質(zhì)A和B含量的RSD值。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測定結(jié)果的RSD分別為0.6%和0.5%，本方法精密度良好。

2.7重復性實驗 另由不同研究實驗人員在不同時間重復“2.6”項下實驗，重新配制各雜質(zhì)100%濃度水平溶液(含雜質(zhì)A和B的濃度分別為22.52 ng·mL-1和22.03 ng·mL-1)，依法連續(xù)測定6次，分別計算雜質(zhì)A和B含量的RSD值。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測定結(jié)果的RSD分別為0.6%和0.8%，二名研究實驗人員共12次測定中，雜質(zhì)A的RSD為1.6%，雜質(zhì)B的RSD為2.2%。本方法中間精密度良好。

2.8穩(wěn)定性實驗 取“2.5”項下雜質(zhì)對照品儲備液(1000%限度濃度)10 mL置于100 mL容量瓶，加乙腈定容至刻度，作為對照品溶液。精密稱取苯磺酸氨氯地平膠囊內(nèi)容物適量，置50 mL離心管中，加入25 mL對照品溶液，渦旋，超聲5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為加標供試品溶液。在0，12，25 h依法檢測，并與初始測定結(jié)果進行對比。結(jié)果表明：對照品溶液和加標供試品溶液放置25 h后，各個雜質(zhì)含量的變化均在80～120%之間，對照品溶液和供試品溶液在25 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.9加樣回收率實驗 配制“2.5”項下雜質(zhì)對照品儲備液，分別精密量取2.5，5和7.5 mL至50 mL容量瓶，加乙腈定容至刻度，制得50%，100%和150%濃度對照品溶液。精密稱取苯磺酸氨氯地平膠囊內(nèi)容物適量(相當于苯磺酸氨氯地平5.0 mg)，分別置于3個50 mL離心管中，分別精密量取加入上述3個濃度對照品溶液25 mL，旋渦，超聲5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，作為50%、100%、150%濃度加標供試品溶液。各濃度加標供試品溶液平行配置3份。取上述溶液依法檢測，計算各濃度平均回收率，并計算RSD值，結(jié)果見表3，4。

表3 雜質(zhì)A加樣回收率的測定結(jié)果 Tab.3 Recovery result of impurity A

表4 雜質(zhì)B加樣回收率的測定結(jié)果 Tab.4 Recovery result of impurity B

結(jié)果表明：雜質(zhì)A加樣回收率范圍為99.7%～104.3%，RSD為1.5%；雜質(zhì)B加樣回收率范圍為100.5%～103.8%，RSD為1.0%。本方法準確度良好。

2.10樣品含量測定 取麗珠集團麗珠制藥廠不同批號的樣品3批(批號：V180901，V180902，V180903)，Pfizer SA參比制劑1批(批號：B217802B)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.1”項下方法測定，計算出不同樣品中雜質(zhì)A和B的含量。結(jié)果上述4批樣品中均未檢測出雜質(zhì)A和B。

3 討論

依據(jù)ICH M7和《中華人民共和國藥典》2020年版“遺傳毒性雜質(zhì)控制指導原則”[12]，結(jié)合苯磺酸氨氯地平膠囊的最大日用劑量，使用毒理學關注閾值(TTC)計算出苯磺酸氨氯地平膠囊中兩種潛在基因毒性雜質(zhì)的可接限度為110×10-6。由于基因毒性雜質(zhì)在極低的濃度水平時也可能導致DNA突變，其測定分析有較強的挑戰(zhàn)。待測定的潛在基因毒性雜質(zhì)從結(jié)構(gòu)上看均含有苯環(huán)基團，有一定的紫外吸收強度，但預實驗結(jié)果表明，HPLC紫外檢測器靈敏度無法滿足雜質(zhì)控制的需求，故選用靈敏度高、專屬性強的LC-MS/MS方法，對其含量進行測定。

實驗中考察了不同類型的色譜柱，結(jié)果表明Agilent poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)上的分離度和峰型最佳。由于該色譜柱填料粒度較細，為2.7 μm，為避免壓力過大，優(yōu)選流速為0.5 mL·min-1；流動相A和B中均加入0.1%甲酸，用以提高待測定組分在質(zhì)譜中的離子化效率，改善其峰型。

從兩個潛在基因毒性雜質(zhì)的來源上來看，雜質(zhì)B為氨氯地平合成過程中的中間體，為非降解雜質(zhì)，僅有較低的殘留風險，建議在原料藥質(zhì)量標準中進行控制；雜質(zhì)A為氨氯地平的潛在氧化降解雜質(zhì)，應結(jié)合多批次穩(wěn)定性數(shù)據(jù)評估風險。

從檢測結(jié)果來看，國產(chǎn)與原研進口的苯磺酸氨氯地平膠囊均未檢出上述潛在基因毒性雜質(zhì)，質(zhì)量趨向一致。本研究首次開發(fā)LC-MS/MS法對苯磺酸氨氯地平膠囊中的非磺酸酯類潛在基因毒性雜質(zhì)進行含量測定，所開發(fā)的方法也可供苯磺酸氨氯地平原料藥及其他劑型參考，為進一步規(guī)范強化本類藥物的質(zhì)量提供技術支持。