利用多重連接探針擴增結合熔解曲線法鑒別五味子與南五味子摻雜*

程華春，王文斌，莫靜，聶晶，，汪波

(1.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065；2.湖北大學生命科學學院，武漢 430062；3.湖北省藥品監督檢驗研究院國家藥品監督管理局中藥質量控制重點實驗室，武漢 430075)

中藥五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實，習稱北五味子；南五味子為木蘭科植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實[1]。長期以來，五味子和南五味子均作五味子使用，自《中華人民共和國藥典》2000年版開始將二者作為兩個品種分開收錄并制定不同質量標準，但對性味歸經、功能主治沒有進行區分，臨床用藥也沒有明確規定，二者常常被混用[2]。對二者的療效各時期醫藥學家持不同觀點[3]，五味子偏于補益五臟，而南五味子斂肺平喘功效更佳，在木脂素類型和含量方面也存在顯著差異[4-6]，化學成分的差異可能是其功效不同的主要原因。此外，二者市場價格差異很大，但外觀形態相似，加工炮制后使鑒定更加困難，致使兩者常摻混出售，給臨床用藥有效性和安全性帶來巨大隱患。因此，開發快速準確鑒別五味子及南五味子的方法對安全用藥具有重要意義。

多重連接依賴性探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術是近年發展起來的一種DNA定性和半定量分析的核酸檢測技術，可同時檢測 40～50 個核苷酸序列，每個擴增片段長度唯一，可通過毛細管電泳分離判斷目標基因的有無及相對含量[7-8]，已廣泛用于基因診斷、甲基化檢測、遺傳疾病分析等多個分子學診斷領域[9-11]。本研究基于五味子ITS2序列38bp處的T/G變異位點[12]，設計多重連接依賴性探針，利用MLPA技術高效、快速、特異等優勢，并與熔解曲線相結合，建立五味子和南五味子的熔解曲線模型，并根據熔解曲線Tm值的差異，建立中藥材五味子和南五味子的分子鑒定方法，為準確鑒別五味子、南五味子及其摻混品提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料 五味子(批號120922-201610)、南五味子(批號121118-201003)對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院，31份商品藥材收集于四川荷花池、安徽亳州、河北安國等藥材市場，經湖北省藥品監督檢驗研究院中藥檢驗研究中心肖凌博士鑒定，16份為五味子，15份為南五味子，樣品信息見表1。

表1 五味子和南五味子樣品信息 Tab.1 Sample information of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera

1.2儀器 電子天平(MS204S，瑞士梅特勒托利多科技有限公司，感量：0.1 mg)，冷凍高速離心機(75002420型，美國Thermo Fisher公司，離心半徑：8 cm)，超微量分光光度計(Nano drop-2000，美國Thermo Fisher公司)，PCR擴增儀(T100型，美國Bio-Rad)，Gel Doc XR+凝膠成像系統(美國Bio-Rad)，DYY-10C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，微波爐(格蘭仕)，MyGo Mini(Life Technologies，Carlsbad，California)，SYERGYUV 超純水系統(美國 Millipore)，GGI54TW蒸汽消毒鍋(ZEALWAY)，BCD-25TMPM冰箱(海爾)，MX-RL-E旋轉混旋儀(大龍興創實驗儀器有限公司)，LWB-26雙列六孔電熱恒溫水浴鍋(上海龍躍儀器設備有限公司)，UF55干燥箱(德國美墨爾特公司)，手動移液器(德國艾本德股份公司)。

1.3試劑 乙二胺四乙酸(分析純，批號：20140728)，氯化鈉(分析純，批號：20150519)，三氯甲烷(分析純，批號：20200601)，異戊醇(分析純，批號：20141114)，異丙醇(分析純，批號：20190902)，無水乙醇(分析純，批號：20210510)，DDH2O，PVP-40(BS912，biosharp，純度≥99.0%)，β-Mercaptoethanol (M8210，Solarbio)，CTAB(C8440，Solarbio)，1.5 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(T010，Solarbio)，植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03，TSINGKE)，DNA產物純化試劑盒(D1300，Solarbio)，金牌Mix(green)(TSE101，TSINGKE)，瓊脂糖(BIOWEST，182215)，DL 1000 DNA Marker (Takara公司)，9°NTMDNA ligase (M0238S，TSINGKE)，2×T5 Fast qPCR Mix (SYBE Green Ⅰ)(TSE202，TSINGKE)，引物和MLPA 探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1MLPA探針設計 在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中下載五味子和南五味子ITS2序列，導入MEGA6軟件篩選主導單倍型并進行比對，五味子ITS2序列第38個堿基為G，南五味子為T，且該位點較穩定。在該位點上下游各截取適宜長度設計兩對探針，使用UNAfold(http：//www.unafold.org/mfold/ applications/dna-folding-form.php)網站對探針質量進行評價，在NCBI GenBank中通過BLAST搜索評估探針序列的特異性，使用Primer3(https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)網站設計擴增引物，設計好的引物和探針交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。新合成的引物和探針使用前在冷凍高速離心機中12 000 r·min-1離心30 min，按照標示加入緩沖液配成10 μmol·L-1的溶液儲存，使用時稀釋成1 μmol·L-1工作溶液備用。探針和引物序列信息見表2。

表2 MLPA探針和引物序列信息 Tab.2 MLPA probe and primer sequence information

1.4.2樣品DNA的制備 分別取對照藥材和樣品粉末50～80 mg，參照文獻[13]的改良CTAB法提取樣品DNA并做適當修改：將樣品放入2 mL離心管中，加入兩粒鋼珠，于研磨儀中研磨2 min，向研磨好的樣品中加入CTAB提取液并于65 ℃下水浴加熱1 h，每隔10 min搖勻一次，水浴后加入等體積三氯甲烷/異戊醇(24：1)，顛倒搖勻后12 000 r·min-1離心5 min。取上清液加入等體積的三氯甲烷/異戊醇(24：1)，顛倒搖勻后12 000 r·min-1離心5 min。將冰的異丙醇加入到1.5 mL離心管中，然后取等體積上清液加入到該離心管，于-20 ℃冰箱放置30 min后拿出，從上往下吸取加入到吸附柱，12 000 r·min-1離心1 min，棄去收集管中廢液。加入無水乙醇，靜置5 min，12 000 r·min-1離心1 min，棄廢液，重復操作兩次。空吸附柱12 000 r·min-1離心2 min，將吸附柱移入1.5 mL離心管中，打開吸附柱蓋子，風干。風干后加入5 ℃預熱的TE緩沖液40～80 μL ，靜置5 min，12 000 r·min-1離心2 min，制備好的DNA樣品原液置于-20 ℃冰箱中保存備用。

使用超微量分光光度計測定DNA 含量，根據A260/A280評估DNA質量，當A260/A280比值<1.8時，說明可能有蛋白質污染，當比值>2.0時，可能有RNA存在，該比值在1.8～2.0范圍內表明DNA質量良好[13-14]。取質量較好的DNA用擴增引物WWZ-F和WWZ-R進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，隨后參照試劑盒中說明書步驟純化，得到MLPA反應的DNA模板。將反應模板逐步稀釋，得到不同含量的DNA模板。另取DNA模板制成摻混樣品，使南五味子所占比例依次為90%，80%，70%，60%，50%，40%，30%，20%，10%，5%。制備好的樣品保存在-20 ℃冰箱中供后續實驗使用。

1.4.3MLPA-熔解反應 取樣品DNA1 μL，探針1.5 μL，加入TE緩沖液5.5 μL，混勻后置PCR儀中進行雜交反應，98 ℃變性5 min，70 ℃雜交20 min，45 ℃取出[15]。雜交完成后，取DNA雜交產物1.28 μL，加入9°N DNA ligase連接酶體系6.72 μL，置PCR儀中45 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，使探針連接成一條完整鏈。冷卻后取5 μL連接產物，加入2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL，正向引物Primer_F 0.8 μL，反向引物Primer_R 0.8 μL，50×Rox Reference Dye Ⅰ 0.4 μL，加DDH2O補齊到20 μL體系，95 ℃ 60 s ；95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，擴增30個循環；72 ℃ 5 min。95 ℃ 保溫3 min后進行熔解程序，熒光采集溫度設置為45～97 ℃(0.05 ℃·s-1)。每個反應進行 3 次重復實驗。

2 結果

2.1探針特異性分析 將表 2中所列探針按照 MLPA 擴增反應要求制備成單一探針和混合探針，分別以五味子及南五味子對照藥材提取的DNA以及混合DNA為模板進行MLPA-熔解反應。單一探針特異性結果見圖1A。從圖中可以看出，五味子DNA模板與五味子探針進行實驗時，產生82.3 ℃熔解曲線峰；南五味子DNA模板與南五味子探針進行試驗時，產生80.7 ℃熔解曲線峰。五味子探針與南五味子DNA模板、南五味子探針與五味子DNA模板以及以TE緩沖液1 μL代替DNA模板進行實驗時，均不產生熔解曲線峰。表明兩個物種只與其對應的MLPA探針進行雜交，不出現非特異性熔解曲線峰，可以認為單一探針的特異性良好。混合探針特異性結果見圖1B。制備的混合探針分別與五味子、南五味子DNA模板進行實驗時，分別產生82.3和80.7 ℃熔解曲線峰，與單一探針結果一致，說明兩種探針混合后并不影響探針特異性，表明混合探針特異性良好。

A.單一探針特異性；B.混合探針特異性。圖1 探針特異性實驗熔解曲線圖譜 A.Single probe specificity ；B.Mixed probe specificity.Fig.1 Melting curve of probe specificity test

2.2敏感性實驗結果 將五味子、南五味子的DNA模板量逐漸由高降低，分別與混合探針雜交進行敏感性試驗，驗證方法的靈敏度。當五味子模板DNA量為221.5，109.4，50.5，25.2，14.1，11.1，5.7，2.6，1.2，0.9，0.45，0.25 ng，南五味子模板DNA量為221.3，110.5，55.1，27.1，11.2，10.3，5.5，1.6，1.1，0.8，0.55，0.4 ng時，可產生相對應的熔解曲線峰，熔解曲線的峰高與模板DNA的量不存在相關性。直到五味子、南五味子模板DNA量降至0.1，0.2 ng時，熔解曲線接近于水平(圖2，圖3)。此結果表明MLPA技術鑒別這兩個物種有較高的靈敏度，五味子的檢出限為0.1 ng，南五味子的檢出限為0.2 ng，且此方法的重復性好，因而可以用于市場上五味子和南五味子的鑒定。

圖2 五味子探針靈敏度實驗結果 Fig.2 The sensitivity test results of Schisandra chinensis probe

圖3 南五味子探針靈敏度實驗結果 Fig.3 The sensitivity test results of Schisandra sphenanthera probe

2.3混合樣品實驗結果 將五味子和南五味子DNA模板按比例混合進行MLPA反應，檢測該方法是否適合檢測混合樣品，結果見圖4。當南五味子所占比例為80%，70%，60%，50%，40%，30%時，能檢測到歸屬于五味子(Tm=82.3 ℃)和南五味子(Tm=80.7 ℃)的熔解曲線雙峰。當南五味子比例下降至20%及更低，北五味子比例下降至10%及更低時，便只產生單一的熔解曲線峰。這表明當五味子樣品中南五味子所占比例≥30%或者南五味子樣品中五味子所占比例時≥20%時可用此方法來檢測摻混樣品。

圖4 混合樣品實驗結果 Fig.4 Test results of mixed samples

2.4市場商品分析 對市場上收集到的31份商品藥材提取DNA后一部分進行MLPA-熔解反應，比較分析所得到的熔解曲線峰；另一部分送至測序公司進行測序，并與GeneBank中的序列對比，確認其基源。16份五味子藥材出現(82.3±0.3) ℃的熔解曲線峰，15份南五味子藥材出現(80.7±0.3) ℃的熔解曲線峰，表明16份為五味子，15份為南五味子，結果與測序結果一致，表明本研究建立的方法檢測結果無誤，根據Tm值能夠準確的將五味子和南五味子區分開。

3 討論

目前關于中藥材的DNA提取大多數基于DNA含量豐富的新鮮干燥葉片，然而在市場上流通以及供臨床使用的更多的是藥材，所以直接以藥材作為DNA提取的原料更為合適。五味子是一種果實類中藥，本課題組前期在DNA提取過程中，首先采用了試劑盒提取的方法，提取到的DNA濃度較低、質量差，通過查閱相關文獻[16]，以種仁為提取材料，對比發現采用改良CTAB法得到的DNA質量最佳。

我國的藥用植物品種繁多，基源復雜。近年來，因為誤用混用造成中藥毒副事件常有發生，因而建立一種簡單準確、易于操作的方法鑒定藥用植物基源確保臨床用藥安全至關重要。相比于性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別來說，分子生物學鑒定技術準確性高、重復性好、不易受環境因素和加工炮制方法的影響，受到了廣大研究者的青睞。目前雖已有學者利用ISSR[17-18]、RAPD[19-20]、DNA條形碼[12，21]等方法對南、北五味子進行了鑒定，但這些方法在檢測速度和檢測準確度方面存在一些局限性。

傳統的MLPA產物采用毛細管電泳進行結果分析，不僅費時，而且將PCR產物取出過程中存在可能產生氣溶膠污染的風險。為彌補傳統MLPA技術的不足，本研究引入熔解曲線分析，在分子生物學基礎上，將MLPA技術和熔解曲線相結合建立了一種快速鑒定五味子和南五味子的方法。選用ITS2序列作為擴增片段，MLPA反應基本步驟包括探針和目的序列 DNA 雜交、連接、PCR 擴增，此方法的特異性體現在探針的設計上，每條探針包括兩個核苷酸片段，只有當兩個片段完全與目的序列雜交互補后才能被連接酶連接成一條完整的序列，進而進行后續反應，即使有一個堿基不匹配也會導致連接反應無法進行。隨后進行PCR擴增和熔解，這兩個步驟只需一個熒光定量PCR儀就能完成，且在完成PCR過程之后，無需將樣品取出直接進行熔解程序，通過實時監控DNA雙鏈熔解過程中熒光信號的積累，就能直觀地看到DNA雙鏈熔解隨溫度變化曲線的差異，擴增片段的堿基序列、片段長度、GC含量都會對Tm值產生影響[22]，從而在不同的位置出現熔解曲線峰，以此將不同的物種區分開。本實驗設計的兩條探針長度分別為113和110 bp，但是實際參與雜交的序列只有約60 bp，其余的為引物和填充序列，對樣品DNA的完整性要求低，即使DNA發生降解也不會對實驗結果產生影響。在不計算DNA提取時間的情況下，僅需要2～3 h就能完成至少16個樣品的鑒定，而且操作簡單、結果準確性高、重現性好。

通過MLPA技術結合熔解曲線能夠高效快速地將五味子和南五味子區分開，在今后的研究中，可以嘗試將此方法應用到含五味子的中成藥的檢測中，同時此研究也可以為其他中藥品種的MLPA鑒定提供參考。