超濾和分子印跡技術聯(lián)用分離延胡索生物堿*

朱俊訪，李博，潘曉瑜，楊悅

(廣東食品藥品職業(yè)學院，廣州 510520)

延胡索為罌粟科(Papaveraceae)紫堇屬Corydalis Vent.植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，其主要活性成分是生物堿類成分，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用，對冠心病、心律失常、胃潰瘍等多種疾病有較好的臨床效果[1-2]。延胡索生物堿的提取純化多采用水提醇沉、大孔樹脂純化等方法[3]，但這些方法成本高、耗時費力，難以滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。為提高產(chǎn)品質(zhì)量及綠色中藥的發(fā)展要求，有必要對延胡索生物堿提取純化工藝進行深入研究。膜技術是一種新型分離技術，具有高效、節(jié)能、無污染、分離效率高等優(yōu)點，在傳統(tǒng)中藥提取方面已經(jīng)取得了很好的研究成果，目前在中藥的生產(chǎn)過程中應用的膜技術主要包括微濾、超濾和納濾[4-5]。分子印跡技術是一種高選擇性的分離技術，在物質(zhì)分離純化領域有著極大的發(fā)展?jié)摿头浅Ｖ匾膽们熬癧6]。目前的膜分離都是以篩分機制實現(xiàn)對物質(zhì)的分離，無法實現(xiàn)對特定物質(zhì)的選擇性分離。而分子印跡膜則將分子印跡聚合物對模板分子的專一識別特性與膜分離的可連續(xù)化操作特點相互結(jié)合，為實現(xiàn)特定物質(zhì)的特異性分離提供了有效途徑。膜技術、分子印跡技術聯(lián)合應用在延胡索生物堿類物質(zhì)的分離筆者尚未見報道。本文將膜分離技術與分子印跡技術相結(jié)合，加以改進，以節(jié)約能耗、降低生產(chǎn)成本為目的，并為膜分離技術在藥物分離方面的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

實驗用膜分離裝置MSM2013(上海摩速科學器材有限公司)；AUY120萬分之一電子天平(日本島津儀器公司，感量：0.1 mg)；UV2600紫外分光光度計(尤尼科儀器有限公司)；聚醚砜平板膜(截留分子量10 000，5000，3500，1000，中科瑞陽膜技術有限公司，批號：2020UE001)；延胡索乙素(THP)對照品(含量≥98%，西安沃森生物科技有限公司，批號：20181226)；葡萄糖(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190706)；甲基丙烯酸(分析純，科密歐化學試劑有限公司，批號：20180808)；偶氮二異丁氰(分析純，科密歐化學試劑有限公司，批號：2019003)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(含量：98%，阿拉丁生化科技有限公司，批號：D1629145)。延胡索購自廣州清平藥材市場，經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學院梁永樞副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1延胡索總生物堿與多糖的含量測定

2.1.1對照品溶液制備 精密稱取延胡索乙素50 mg置于50 mL量瓶中，加入5%硫酸溶液1 mL溶解，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值4.0)定容至刻度，得對照液母液。精密量取對照液母液1 mL至10 mL量瓶，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值4.0)定容至刻度，得對照儲備液。

2.1.2延胡索生物堿標準曲線的制備 分別精密量取對照儲備液0，0.2，0.5，0.6，0.8，1.0，1.3，1.5 mL至5 mL量瓶，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH值4.0)定容至刻度，得系列對照品溶液。分別精密吸取延胡索乙素對照品溶液1.0 mL置于分液漏斗中，各加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液12.0 mL，再加0.04%溴甲酚綠溶液3.0 mL，用三氯甲烷9.0 mL振搖提取2 min，靜置40 min，取三氯甲烷層置于有0.2 g無水硫酸鈉的具塞試管中，在409 nm處測定吸光度(A)[7-8]。得吸光度(A)與濃度(C)的線性關系為A=0.054 6C+0.038 4，R2=0.999 0。

2.1.3多糖標準曲線 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖，配制0.1 mg·ml-1葡萄糖的標準溶液。精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL葡萄糖標準溶液至10 mL具塞試管，加純化水至2 mL，分別加入5%苯酚1 mL，98%硫酸5 mL，搖勻靜置30 min，于489 nm測定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[9]，得吸光度(A)與濃度(C)的線性關系為A=7.082C+0.013 2，R2=0.999 1。

2.2延胡索生物堿樣品制備

2.2.1延胡索提取液的制備 稱取經(jīng)粉碎過孔徑約0.25 mm(60目)篩的延胡索粉末300 g，加水10 L浸泡，浸泡3次，每次24 h，過濾，合并濾液，得延胡索提取液。

2.2.2膜分離延胡索生物堿研究[10-13]

(1)不同截留分子量超濾膜分離研究。量取延胡索提取液4份，每份5 L，室溫下用孔徑5 μm微孔濾膜抽濾，得延胡索微濾液。取4份延胡索微濾液，分別使用截留分子量為10 000，5000，3500，1000的聚醚砜平板膜進行錯流循環(huán)超濾(圖1)，膜有效面積為70 cm2，得4份延胡索超濾液。按“2.1.2”項方法測定微濾液、4份超濾液中生物堿含量，并計算各濾液的固形物含量、生物堿轉(zhuǎn)移率和除雜率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，隨著超濾膜截留分子量的減小，料液中固形物含量、生物堿總量和轉(zhuǎn)移率都依次降低，但隨著除雜率不斷提高，生物堿含量先增大后減小。其中分子量為10 000超濾液中的生物堿總量最高，但由于除雜率較低導致其生物堿含量不及分子量為5000超濾液。綜合考慮生物堿轉(zhuǎn)移率、除雜率以及生物堿含量，初步選定截留分子量為5000的超濾膜分離效果較好。

表1 延胡索提取液、微濾液和超濾液結(jié)果 Tab.1 Results of yanhusuo extract，microfiltration and ultrafiltration

圖1 錯流循環(huán)超濾裝置 Fig.1 Cross flow circulating ultrafiltration device

(2)超濾膜動態(tài)分離研究。量取延胡索提取液5 L，室溫下先用孔徑5 μm微孔濾膜抽濾，再使用截留分子量為5000的聚醚砜平板膜進行錯流循環(huán)超濾，每超濾600 mL收集一份超濾液，共收集6份，按“2.1.2”項和“2.1.3”項方法分別測定超濾液中THP和多糖含量，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，THP能較好地穿過超濾膜，而大部分的多糖則被截留，說明該超濾膜能穩(wěn)定有效地截留大分子物質(zhì)。

圖2 不同時間超濾液中THP和多糖含量 Fig.2 Contents of THP and polysaccharide in ultrafiltration at different times

(3)料液超濾溫度研究。采用截留分子量為5000的超濾膜，操作壓力設為0.35 MPa，過膜速率為400 mL·min-1，測定不同溫度下膜通量的變化，結(jié)果見圖3。由圖中曲線可以看出，當溫度在<30 ℃，膜通量隨溫度的升高而明顯升高，這可能與溶液溫度的升高降低了溶液粘度并且提高了超濾膜兩側(cè)的溶質(zhì)的擴散速度有關。溫度>30 ℃，膜通量隨溫度的升高增加緩慢。綜合考慮溫度對膜通量影響和實際操作性，初步選定料液超濾溫度為30 ℃。

圖3 料液溫度對膜通量的影響 Fig.3 Effect of feed liquid temperature on membrane flux

(4)超濾操作壓力研究。采用截留分子量為5000的超濾膜，溶液溫度設定為30 ℃，過膜速率為400 mL·min-1，測定不同操作壓力下膜通量的變化，結(jié)果見圖4。由圖中曲線可以看出，膜通量隨著操作壓力的增大迅速增大，壓力是超濾膜的傳質(zhì)推動力，料液中的溶劑和小分子物質(zhì)在壓力推動作用下通過膜，壓力越大推動力越強通量越大。當操作壓力達到0.3MPa后膜通量增加緩慢變化趨于穩(wěn)定，這可能與操作壓力增大促進超濾膜表面形成凝膠層有關，膜表面的凝膠層增大了料液的透過阻力。結(jié)合試驗結(jié)果與實際操作條件，初步選定最佳操作壓力為0.35 MPa。

圖4 操作壓力對膜通量的影響 Fig.4 Effect of operating pressure on membrane flux

(5)超濾過膜速率研究。采用截留分子量為5000的超濾膜，溶液溫度設定為30 ℃，操作壓力設為0.35 MPa，測定不同過膜速率下膜通量的變化，結(jié)果見圖5。由圖中曲線可以看出，膜通量隨著過膜速率的增大迅速增大，增大流速可以起到邊滲透邊洗膜的作用，當過膜速率達到400 mL·min-1后膜通量增加緩慢變化趨于穩(wěn)定，這可能與流速加快增加了組件壓力損失有關。結(jié)合實驗結(jié)果與實際操作條件，初步選定最佳過膜速率為400 mL·min-1。

圖5 過膜速率對膜通量的影響 Fig.5 Effect of membrane passing rate on membrane flux

(6)超濾工藝優(yōu)化。根據(jù)實驗結(jié)果，以溫度、壓力和過膜速率為影響因素，應用中心組合實驗方法進行三因素三水平的實驗設計[14-15]，以延胡索生物堿透過率和高分子截留率為響應值，采用綜合評分(Y)評價超濾工藝，延胡索中含有大量的多糖類物質(zhì)，因此延胡索生物堿透過率與多糖截留率均為評價指標，并予以相同的權(quán)重，由此制定的評分標準為Y=生物堿透過率×0.5+多糖截留率×0.5。星點設計的因素水平見表2。響應面實驗設計方案及實驗結(jié)果見表3。

表2 設計因素及水平 Tab.2 Table of design factors and levels

表3 響應面實驗設計方案及試驗結(jié)果 Tab.3 Response surface experimental design scheme and results

利用統(tǒng)計分析軟件Design-expert對所得數(shù)據(jù)進行分析，回歸分析結(jié)果見表4。當Prob>F值小于0.05即表示該項指標對模型影響顯著，從回歸分析結(jié)果看，整體模型的Prob>F值=0.001 5，表明該二次方程顯著。操作壓力(Prob>F=0.001 1)和料液溫度(Prob>F=0.017 3)與Y的線性關系顯著。從Prob>F值可推斷出各因素對多糖得率的影響順序為：壓力>溫度>過膜速率。失擬項的Prob>F值為0.615 2，不顯著，該模型擬合程度較好，從而說明該模型能夠?qū)Τ瑸V膜分離延胡索生物堿進行準確的預測和分析。進行多元回歸擬合，得Y對A、B和C的二次多元回歸方程。Y=66.56-0.72A+1.24B+0.33C+0.94AB-0.29AC+0.022BC-1.74A2-1.44B2-0.97C2，相關系數(shù)R2=0.942 4。

表4 回歸分析結(jié)果 Tab.4 Regression analysis results

圖6分別為3個影響因素兩兩之間相互作用的響應面曲線，圖中顯示了溫度、壓力和流速之間存在交互作用，隨著其中兩個因素的增大，綜合評分先增大后減小，影響因素B>A>C，3個因素中超濾壓力對綜合評分的大小影響最顯著。經(jīng)計算確定截留分子量為5000的超濾膜分離延胡索生物堿的最佳工藝為料液溫度29.5 ℃，操作壓力為0.37 MPa，過膜流速為419 mL·min-1，預測綜合評分Y結(jié)果為66.87。

圖6 各因素的相互影響 Fig.6 Interaction of various factors

(7)膜分離驗證試驗。按上述工藝進行重復性試驗3次，所得超濾液按“2.1.2”項和“2.1.3”項方法測定延胡索生物堿和多糖含量，計算延胡索生物堿透過率、多糖截留率和綜合評分Y，結(jié)果見表5。延胡索生物堿平均透過率為60.8%，多糖截留率為72.7%，綜合評分Y為66.78與預測結(jié)果接近，說明該實驗所得到的數(shù)學模型可靠，其工藝參數(shù)準確可信，具有良好的預測性。

表5 驗證實驗結(jié)果 Tab.5 Results of validated experimental%

2.3分子印跡膜分離延胡索生物堿研究

2.3.1分子印跡膜制備 按文獻[16]所述過程，采用紫外光引發(fā)聚合，制備延胡索乙素分子印跡復合膜，步驟如下：取模板分子THP 溶解在三氯甲烷中，加入5倍量功能單體MAA，超聲混勻，加入20倍量的交聯(lián)劑EDMA，最后加入AIBN，超聲溶解，得預聚液，將PVDF膜浸泡于預聚液中20 min，取出通過紫外光引發(fā)聚合，制備THP分子印跡復合膜。非印跡復合膜的制備除不加模板分子THP外，其余操作同印跡復合膜的制備[16]。

2.3.2THP印跡復合膜分離延胡索生物堿 自制2個一側(cè)帶圓孔的玻璃池，將THP印跡復合膜(直徑1.5 cm)固定于兩玻璃池的圓孔之間，一個為滲透池，另一個為透過池，組成滲透裝置。滲透池中放入截留分子量為5000的超濾液100 mL，透過池中放入2%醋酸溶液100 mL，磁力攪拌器攪拌24 h，分別在6，12和24 h取樣，按“2.1.2”項方法測定生物堿含量和24 h后透過液固形物中生物堿含量，考察THP印跡復合膜對超濾液中生物堿成分的透過性能，重復3次，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示在滲透6，12和24 h后 PVDF膜的透過液生物堿透過率最高，非印跡復合膜的透過液生物堿透過率最低，THP印跡復合膜膜透過液固形物中生物堿含量最高，達到7.5%。

表6 PVDF膜、THP印跡復合膜和非印跡復合膜不同時間透過結(jié)果 Tab.6 Transmission results of PVDF membrane，THP imprinted membrane and non imprinted membrane at different times

3 討論

延胡索主要成分為生物堿，此外還含有大量的淀粉、樹脂和多糖等大分子物質(zhì)，其中延胡索總生物堿在水中略溶，溶解度大約10 mg·mL-1[17]，基于操作便捷與經(jīng)濟環(huán)保考慮本文采用水浸泡提取。超濾中膜的截留分子量越小，除雜率越高，但有效成分損失也越大，并且滲濾速度和膜通量下降明顯。提高壓力能增加膜通量，但也會促進膜表面形成凝膠層增加滲透阻力。升高溫度能促進膜表面溶質(zhì)向主體運動，提高過濾速度，但也會相應加速超濾膜老化。增大流速能減小膜表面凝膠層的厚度，但也會增加膜表面的磨損。本研究采用截留分子量為5000的超濾膜可獲得較好的生物堿轉(zhuǎn)移率和較高的膜通量，并能有效除去延胡索提取液中的大分子物質(zhì)。延胡索提取液使用孔徑5 μm微濾膜抽濾，然后在溶液溫度為29.5 ℃，操作壓力為0.37 MPa，過膜流速為419 mg·min-1，使用截留分子量為5000的超濾膜對延胡索提取液進行錯流循環(huán)超濾，所得超濾液中生物堿含量最高。鐘蓮等[18]研究了石硫法、水提醇沉法、D101大孔樹脂和732型陽離子樹脂對延胡索乙素的純化工藝，延胡索乙素含量分別為0.41%，0.30%，1.08%和1.19%，與本文結(jié)果比較顯示，超濾法具有一定優(yōu)勢。超濾法與傳統(tǒng)方法比較，不僅操作簡單、省時高效、節(jié)能，且無二次污染，如果清洗使用得當超濾膜可長期循環(huán)使用，具有較高的經(jīng)濟性。膜分離在中藥化學成分分離中應用，需面臨膜污染與膜吸附的問題，一般可通過膜改性來解決此方面問題，這也是筆者進一步研究的方向。

THP印跡復合膜和非印跡復合膜在聚合過程中在PVDF膜表面形成了聚合物，膜的孔徑變小，而THP印跡復合膜表面存在延胡索乙素三維結(jié)構(gòu)空穴，3種膜的孔徑大小為PVDF膜>THP印跡復合膜>非印跡復合膜，因此印跡膜分離延胡索生物堿試驗中PVDF膜的生物堿透過率最高，非印跡復合膜的生物堿透過率最低。經(jīng)過24 h膜滲透，由于延胡索中生物堿成分的結(jié)構(gòu)與模板分子THP的結(jié)構(gòu)相似，相對其他成分更容易通過印跡膜的空穴結(jié)構(gòu)，而PVDF膜和非印跡復合膜不存在印跡空穴，料液中各種成分的透過率差異小，因此THP印跡復合膜的透過液固形物中生物堿含量最大。

本文首先對延胡索提取液進行超濾，所得超濾液中生物堿含量比原提取液中生物堿含量提高了23%，超濾液利用分子印跡膜進一步純化，最終生物堿含量提高了3倍。綜上，膜分離技術能有效去除延胡索水提液中的大分子雜質(zhì)，明顯提高生物堿含量，且分子印跡膜分離實驗顯示其在分離延胡索生物堿的可行性，本研究為膜技術和分子印跡技術聯(lián)用分離中藥有效物質(zhì)奠定了一定的基礎。