軟棗獼猴桃最佳生根培養(yǎng)基的篩選

黃海燕，陳繼宏，李 敏，蔣明星，龍巧芳，韓世明，王月霞

（六盤(pán)水市師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤(pán)水 553000）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）是屬于獼猴桃科（Actirlidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）的多年生藤本落葉植物，又名軟棗子、猴桃梨、藤瓜等。世界上的獼猴桃屬植物總共有66種，中國(guó)有62種。由此可見(jiàn)，獼猴桃在我國(guó)分布廣泛，其中軟棗獼猴桃是獼猴桃屬中在我國(guó)分布最廣的野生果樹(shù)之一，主要分布于我國(guó)華北、東北、西北及長(zhǎng)江流域各省，尤其以黑龍江、吉林和遼寧等地資源最為豐富[1]。世界上軟棗獼猴桃主要栽培品種有74個(gè)，其中我國(guó)有11個(gè)[2]是軟棗獼猴桃的主產(chǎn)區(qū)。軟棗獼猴桃的枝條多攀爬在樹(shù)枝或者樹(shù)干上，葉柄呈紅色，葉小而扁長(zhǎng)，葉為互生，它的葉片、葉柄和莖部都沒(méi)有毛，花為白色且較小，有淡淡的香氣，果實(shí)呈綠色或黃綠色，果實(shí)為漿果且果實(shí)的果皮光滑無(wú)斑點(diǎn)，果實(shí)柔軟多汁、味道及其鮮美可口，果實(shí)看起來(lái)像蘋(píng)果，雖然果實(shí)很小但營(yíng)養(yǎng)豐富，且富含維生素C，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的醫(yī)療保健效果[3]而受到廣大人民群眾的喜愛(ài)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的軟棗獼猴桃幼嫩莖段采自水城縣米籮鄉(xiāng)貴州省獼猴桃產(chǎn)學(xué)研基地，米籮鄉(xiāng)的區(qū)域海拔為1 200 m左右。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇

本試驗(yàn)采用一年生軟棗獼猴桃?guī)б秆康哪矍o段作為接種材料，早春季節(jié)（早春季節(jié)植物體幼嫩部位分化能力高、含毒素少[4]）從母株上長(zhǎng)出的側(cè)枝，在中午12時(shí)剪20～30 cm長(zhǎng)的枝條，要剪生長(zhǎng)強(qiáng)壯、無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)病菌的幼嫩枝條。

1.2.2 外植體消毒

將從獼猴桃基地取回來(lái)的一年生帶腋芽的軟棗獼猴桃外植體用水清洗干凈，然后剪去葉子和老的莖段。用剪刀剪切外植體，剪切的長(zhǎng)度1.5～2.5 cm最佳，每個(gè)接種的外植體最少帶有一個(gè)腋芽。用洗潔精浸泡30 min（在此期間用玻璃棒隔幾分鐘輕攪拌1次），之后用細(xì)流水沖洗2 h[5]。期間，根據(jù)沖洗時(shí)間，先把無(wú)菌水、裝著濾紙的培養(yǎng)皿、接種工具、升汞、酒精燈、打火機(jī)、燒杯、培養(yǎng)基等放入超凈工作臺(tái)，再把超凈工作臺(tái)的紫外燈開(kāi)起殺菌，殺菌30 min（紫外殺菌在關(guān)閉，最好等10 min左右再開(kāi)始接種，避免紫外線輻射損傷皮膚），殺菌時(shí)不開(kāi)吹風(fēng)，先用75%酒精棉擦洗戴著無(wú)菌手套的雙手，再用75%酒精棉擦洗盛有外植體的容器壁進(jìn)行消毒后再放進(jìn)超凈工作臺(tái)，用75%的乙醇浸泡30 s。然后用無(wú)菌水清洗4次后（每次清洗3 min，用鑷子輕輕攪拌），用0.15%的升汞溶液浸泡7 min（用鑷子輕輕攪拌）。然后用無(wú)菌水清洗6～7次（每次3 min），最后用鑷子把接種的外植體放在放有無(wú)菌紙的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌紙把外植體上的水分吸干（在接種材料上蓋上一層無(wú)菌紙，以減少污染），消毒完成。

1.2.3 外植體接種

將消毒處理好的外植體每瓶2～4個(gè)，（培養(yǎng)皿里的材料放于酒精燈的后面，接種時(shí)手不能放在裝有外植體的培養(yǎng)皿上，整個(gè)接種過(guò)程必須在火焰的正前方完成，以確保無(wú)菌的狀態(tài)），把滅菌的鑷子拿出來(lái)放在酒精燈火焰上方灼燒，第一次多燒一下，放在酒精燈的旁邊冷卻備用，每瓶接種前和完成之后需將培養(yǎng)瓶瓶口一圈灼燒和瓶蓋要在火焰上方過(guò)一下火，以免瓶口和瓶蓋上附著的細(xì)菌或真菌進(jìn)入瓶?jī)?nèi)污染接種的外植體，以防影響試驗(yàn)結(jié)果。接種完成之后要編號(hào)、做好記錄、拍照等工作，在長(zhǎng)出芽后，用幼芽轉(zhuǎn)接。

1.2.4 生根培養(yǎng)

當(dāng)培養(yǎng)的植株長(zhǎng)至4～5 cm，從節(jié)間剪成單節(jié)帶芽莖段接種到以1/2 MS附加不同濃度的生長(zhǎng)激素NAA和IBA，濃度分別為0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6 mg/L，60 d后觀察帶芽莖段的生根情況，統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)與平均根數(shù)。

平均根數(shù)（條/株）＝總根數(shù)（條）/接種外植體數(shù)（株）[6]。

1.2.5 培養(yǎng)條件

各培養(yǎng)階段溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度照2 000 lx，光周期12 h/d。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖和7.2 g/L瓊脂，附加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合試驗(yàn)，pH值5.8。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，利用SPSS軟件作顯著性差異分析[7]。

2 結(jié)果分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)獼猴桃莖段的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的污染率有所下降，但在消毒時(shí)間為8 min時(shí)接入的外植體存活率出現(xiàn)下降見(jiàn)表1。

表1 消毒時(shí)間對(duì)軟棗獼猴桃莖段污染率的影響Tab.1 The effect of disinfection time on the pollution rate of stem segment of Actinidia mollissima

隨著消毒時(shí)間的增加，污染率有所降低，但是當(dāng)消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)對(duì)外植體有所損害，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)消毒時(shí)間為7 min時(shí)存活率和污染率最適合。因此，軟棗獼猴桃?guī)б秆康那o段在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%的氯化汞中的最佳消毒時(shí)間7 min。所以，后期做組織培養(yǎng)時(shí)要準(zhǔn)確把握消毒時(shí)間，由于所選材料不同，消毒需要的時(shí)間也不相同，試驗(yàn)人員根據(jù)所做試驗(yàn)材料先做一次預(yù)試驗(yàn)，選出最好的消毒時(shí)間，避免影響試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 篩選軟棗獼猴桃生根最適培養(yǎng)基

將生長(zhǎng)物質(zhì)NAA和IBA進(jìn)行正交試驗(yàn)，NAA和IBA正交有互作效用，軟棗獼猴桃的生根效果顯著增強(qiáng)。不同激素濃度的NAA和IBA正交軟棗獼猴桃的生根情況，見(jiàn)表2。

表2 不同激素濃度的NAA和IBA正交軟棗獼猴桃的生根情況Tab.2 The rooting of Actinidia mollissima orthogonal with NAA and IBA at different hormone concentrations

根據(jù)本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)整理與分析所得的結(jié)果來(lái)看，平均根長(zhǎng)R18和R26（對(duì)照）軟棗獼猴桃的根長(zhǎng)差異達(dá)極顯著水平，R18與其他處理之間達(dá)顯著水平，R1和R26（對(duì)照）差異達(dá)顯著水平，除R18和R26組合外，其他處理之間差異不顯著。平均根數(shù)目各處理之間差異不顯著。

3 討論

根據(jù)本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)整理與分析的結(jié)果來(lái)看，在軟棗獼猴桃的生長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中激素配比是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同的濃度激素配比直接影響軟棗獼猴桃的生長(zhǎng)速率，進(jìn)而影響根的生長(zhǎng)。為了避免影響試驗(yàn)結(jié)果，選取材料時(shí)，需從實(shí)驗(yàn)室選取生長(zhǎng)狀況一致的愈傷組織材料。本試驗(yàn)結(jié)果表明篩選出的軟棗獼猴桃生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA0.4 mg/L+30 g/L蔗糖+7.2 g/L瓊脂，平均生根數(shù)達(dá)5.3條/株，平均根長(zhǎng)為0.97 cm。由于生長(zhǎng)素NAA和IBA有互作作用，所以當(dāng)2種生長(zhǎng)素混合一起對(duì)軟棗獼猴桃進(jìn)行使用時(shí)，生長(zhǎng)素的效果顯著增強(qiáng)，軟棗獼猴桃的根長(zhǎng)和根數(shù)達(dá)到最大。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，在生長(zhǎng)激素NAA和IBA濃度逐漸升高時(shí)，在組織培養(yǎng)過(guò)程中軟棗獼猴桃根系的生長(zhǎng)（生根數(shù)和根長(zhǎng)）出現(xiàn)了先增后減的現(xiàn)象，此情況說(shuō)明植物生長(zhǎng)激素的用量并不是越多越好，而是有一定的范圍要求，超過(guò)此范圍要求都不利于植物生長(zhǎng)。并且生長(zhǎng)素濃度過(guò)低時(shí)，對(duì)植株的效用不是很大，植株的生長(zhǎng)效果并不是很好。