添加前體對2株真菌次級代謝產物及其生物活性的影響*

薛欣怡，張 翼,2,3，廖清楠，馮昀鎧，胡雪瓊，劉亞月,2,3**

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，湛江市腦健康海洋藥物與營養品重點實驗室，廣東海洋大學海洋藥物研究所，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學深圳研究院海洋醫藥研發中心,廣東深圳 518120；3.大連工業大學,海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,遼寧大連 116034)

微生物來源次級代謝產物是目前藥物先導化合物的重要來源之一。傳統研究主要集中在單一培養條件下微生物發酵液和菌絲體中活性化合物的提取分離，這導致經常重復發現已被研究過的化合物[1]。研究人員對多種真菌和細菌進行全基因組測序發現，能夠編碼化合物的基因數目非常龐大，真菌和細菌可產生的化合物遠遠超過目前被發現的化合物數量，表明微生物在單一培養條件下產生生物活性化合物的潛力被嚴重低估，很多基因可能處于沉默狀態?，F有研究發現，通過敲除、引入異源表達微生物基因、調節啟動子、誘導突變或改變培養條件等方式挖掘微生物次級代謝產物的生物合成基因簇，也許會產生更多的次級代謝產物[2-4]。而添加前體物質是一種簡單有效的策略，它是指在發酵培養基中添加一種在微生物生物合成過程中能易于或直接結合到最終化合物的物質，使某些次級代謝產物的產量有較大提高或可能產生新的化合物[5]。Valente等[6]研究在培養基中添加不同前體物質對內生真菌Penicilliumcrustosum次級代謝產物的影響，結果發現，添加ferulic/quinic acids和添加cinnami/3,4-(methylenedioxy)能夠產生新化合物5-hydroxy-7-methoxy-4-methylphthalide。Wang等[7]在對內生真菌SpicariaelegansKLA03培養過程中添加L-色氨酸和D-色氨酸，從其次級代謝產物中分離得到3種新的細胞松弛素，活性研究結果表明三者對A-549細胞系顯示出細胞毒活性，半數抑制濃度(IC50)值分別為8.2 μmol/L、20.0 μmol/L和3.1 μmol/L。自然界中存在大量的微生物，但是目前添加前體物質對先導化合物影響的研究只涉及天然資源中的一小部分，尤其是內生微生物的研究中關于通過添加前體物質針對性改變菌株次級代謝產物的工作尚少，此方向具有巨大的研究潛力。

本研究在前期研究中發現，紅樹植物楊葉肖槿(Thespesiapopulnea)來源內生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002中的次級代謝產物中可能具有豐富的生物堿和萜類化合物。通過查閱文獻得知，這兩類化合物的前體物質多為氨基酸和甲戊二羥酸[8,9]。因此在前期研究的基礎上[10,11]，本研究選取馬鈴薯葡萄糖液體(Potato Dextrose Broth，PDB)培養基和察氏(Czapek′s)培養基，分別添加2種前體物質(甲戊二羥酸和酪氨酸)對菌株YX-001與YX-002進行微量發酵，通過分析菌株次級代謝產物的產量、HPLC指紋圖譜、乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制活性、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除和鹵蟲致死率的變化，探究添加前體物質對菌株次級代謝產物的影響，擬為進一步開展菌株Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002次級代謝產物的研究及藥物先導化合物的發現奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

內生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002分別采集于廣東湛江紅樹林國家級自然保護區的紅樹植物楊葉肖槿(Thespesiapopulnea)的根部和葉部，通過用真菌ITS引物ITS1和ITS4擴增真菌DNA序列，所得的堿基序列在Genebank中用Blast進行進化樹相似性分析，分別鑒定為Talaromycessp.(Genbank登錄號：MN826194)和Penicilliumsp.(Genbank登錄號：MN826202)，現均保存于廣東海洋大學食品科技學院海洋藥物研究所。

1.1.2 培養基

PDB培養基：稱取馬鈴薯汁500 mL、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g和海鹽20 g，加入純水定容至1 L，置于高壓滅菌鍋滅菌30 min (1×105Pa)，備用。

Czapek′s培養基：稱取蔗糖30 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01g、NaNO32 g和海鹽20 g，加入純水定容至1 L，調節pH值至7.2±0.2，置于高壓滅菌鍋滅菌30 min (1×105Pa)，備用。

1.1.3 試劑與儀器

前體物質甲戊二羥酸以水為溶劑，酪氨酸以5%的稀鹽酸為溶劑，均配制成10 mg/mL的溶液，經0.22 μm濾膜過濾后備用。

試劑：AChE(C3389)、碘代硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine Iodide,ATCI,DA0048)、牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA,A1933)、DPPH(D9132)、海鹽(S9883)均購自Sigma-Aldrich，5,5′-二硫代二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoic acid,DTNB,D8130)購自Ruibio公司，鹵蟲卵購自中國愛家水族館，其他試劑均為國產分析純。

儀器：WFH-201B多功能紫外透射儀(上海精科實業有限公司),霉菌培養箱及生物安全柜(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Epoch2酶標儀(美國BioTek公司)，R-300旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)，薄層層析板(GF254，青島邦凱高新技術材料有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備

將待培養的2株海洋真菌放進霉菌培養箱中活化過夜(28℃、濕度80%)，而后將活化的菌種接種到預先滅菌的PDB培養基(200 mL)中，置于霉菌培養箱(28℃)中搖床(轉數120 r/min)培養3-4 d，待菌落孢子生長茂盛，備用。

1.2.2 前體物質的添加

采用12孔板對菌株進行微量培養，每孔分別加入2 mL培養基(PDB培養基/Czapek′s培養基)和200 μL種子液，置于霉菌培養箱(28℃)培養3 d后，分別加入一定量的溶劑或前體物質(甲戊二羥酸/酪氨酸)，使樣品的終濃度為1 mg/mL，每組做3個平行，而后繼續培養14 d。

前體組：2 mL培養基、200 μL 種子液、245 μL前體溶液(甲戊二羥酸/酪氨酸)。

對照組：2 mL培養基、200 μL 種子液、245 μL水。

鹽酸組：2 mL培養基、200 μL 種子液、245 μL 5%稀鹽酸。

1.2.3 菌株次級代謝產物的產量及HPLC分析

將上述培養好的菌株分別加入等體積的甲醇浸提3次后，離心15 min (3 000 r/min)，取上層清液。減壓濃縮獲得粗提物的水溶液后，用乙酸乙酯萃取3次，再次減壓濃縮，干燥得到粗浸膏，即為樣品，稱量并做好記錄。

HPLC分析條件：樣品用色譜純甲醇溶解，配制成濃度為5 mg/mL的溶液，進樣量為10 μL。洗脫條件為0-10 min，5%-95%的乙腈-水梯度洗脫；10-13 min，95%乙腈-水等度洗脫；13-17 min，95%-5%的乙腈-水梯度洗脫；17-20 min，5%的乙腈-水等度洗脫，流速為0.6 mL/min。DAD檢測器信號采集波長為190-400 nm，本實驗檢測波長為210 nm。

1.2.4 菌株次級代謝產物的生物活性分析

(1)AChE抑制活性測試。

采用優化的Ellmans比色法測定AChE的體外抑制活性[12]。稱取一定量的樣品，用甲醇溶解至10 mg/mL，在96孔板的每個孔中加入100 μL樣品溶液，待樣品中的有機溶劑揮發干，依次將1 μL二甲基亞砜(DMSO)、49 μL PBS、10 μL 0.2 U/mL AChE和20 μL DTNB加入每個孔中，置于培養箱保溫10min (37℃)。將孔板取出后再加入20 μL 乙酰硫代膽堿(ATCh)，繼續孵育20 min (37℃，恒溫恒濕)，通過酶標儀測定λ=405 nm處的吸光度D405，以鹽酸多奈哌齊作為AChE抑制活性測試的陽性對照。抑制率的計算公式如下：

抑制率(%)=

100%，

其中，Dsample blank表示加入樣品和BSA組的吸光度，Dsample表示加入樣品和AChE組的吸光度，Dcontrol表示只加入AChE組的吸光度，Dblank表示只加入BSA組的吸光度。

(2)DPPH自由基清除活性測試。

采用Sharma等[13]描述的方法，在96孔板中測定DPPH自由基清除活性。樣品用甲醇溶解至10 mg/mL，備用。各反應體系均為100 μL。將96孔板置于暗處30 min后，通過酶標儀測定λ=517 nm處各反應體系的吸光度A，以維生素C為陽性對照，每組設置3個平行。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

清除率(%)=

100%，

其中，Asample表示含有50 μL DPPH和50 μL樣品的DMSO溶液反應體系的吸光度，Acontrol表示含有50 μL DPPH和50 μL DMSO溶液的反應體系的吸光度，Asample blank表示含有50 μL甲醇和50 μL樣品的DMSO溶液反應體系的吸光度，Ablank表示含有50 μL甲醇和50 μL DMSO溶液的反應體系的吸光度。

(3)鹵蟲致死活性測試。

采用96孔板測試樣品對鹵蟲的致死活性[14]。每孔加199 μL含鹵蟲幼體的溶液(每孔約含20只鹵蟲)，制成測試培養板。樣品以DMSO為溶劑，濃度為10 mg/mL，每個培養板孔中加入1 μL樣品，終濃度為50 μg/mL，設3個平行樣。在恒溫培養箱中培養24 h(28℃，保持光照)后，統計各孔中鹵蟲的總數和死亡數，陰性和陽性對照分別為DMSO和秋水仙堿。鹵蟲致死率計算公式如下：

鹵蟲致死率(%)=[(樣品組致死率-對照組致死率)/對照組存活率]×100%。

2 結果與分析

2.1 添加前體物質前后菌株次級代謝產物的產量和HPLC指紋圖譜變化情況

2.1.1 產量變化情況

對菌株YX-001[圖1(a)]而言，在兩種培養基中添加甲戊二羥酸都可使菌株次級代謝產物的產量提高。在PDB培養基中添加酪氨酸，可使菌株YX-001的次級代謝產物的產量降低，而在Czapek′s培養基中添加酪氨酸，可使該產量提高。進一步分析可知，在PDB培養基中，酪氨酸前體組中菌株次級代謝產物的產量遠低于鹽酸組，表明菌株YX-001次級代謝產物的產量增加主要是由酸性環境引起，酪氨酸的加入反而會抑制菌株YX-001的代謝；在Czapek′s培養基中，鹽酸組中菌株次級代謝產物的產量低于對照組，但酪氨酸前體組中菌株次級代謝產物的產量顯著高于鹽酸組，表明酸性環境可能會抑制菌株YX-001的代謝，但酪氨酸的加入可顯著促進菌株YX-001的代謝。

對菌株YX-002[圖1(b)]而言，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可使菌株YX-002的次級代謝產物產量提高，尤其是鹽酸組和酪氨酸前體組，其代謝產物顯著增加(P<0.000 1)。進一步分析可知，在PDB培養基中，酪氨酸前體組中菌株次級代謝產物的產量低于鹽酸組，表明菌株YX-002次級代謝產物的產量增加主要是由酸性環境引起；在Czapek′s培養基中，酪氨酸前體組中菌株次級代謝產物的產量顯著高于鹽酸組，表明酸性環境下，酪氨酸的加入可促進菌株YX-002的代謝。

2.1.2 HPLC指紋圖譜變化情況

對菌株YX-001(圖2)而言，與對照組相比，在添加甲戊二羥酸和酪氨酸2種前體物質后，除在PDB培養基中酪氨酸前體組中菌株次級代謝產物的吸收峰減少外，其余各實驗組中菌株次級代謝產物的吸收峰均有增加，表明這些條件下菌株YX-001可能產生了新的次級代謝產物。

對菌株YX-002(圖3)而言，與對照組相比，在添加甲戊二羥酸和酪氨酸2種前體物質后，無論是PDB培養基還是Czapek′s培養基中菌株次級代謝產物的吸收峰都明顯增多。與對照組相比，在保留時間tR=9.5 min處的新的吸收峰僅在甲戊二羥酸和酪氨酸前體組中出現，而鹽酸組沒有，表明該吸收峰可能是由于添加甲戊二羥酸和酪氨酸前體產生的。

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium)，y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖1 菌株YX-001和YX-002在不同培養條件下的產量Fig.1 Yield of strains YX-001 and YX-002 obtained under different media conditions

2.2 添加前體物質前后菌株次級代謝產物生物活性的變化情況

2.2.1 AChE抑制活性

對菌株YX-001[圖4(a)]而言，在PDB培養基中，添加甲戊二羥酸可降低菌株次級代謝產物的AChE抑制活性，而添加酪氨酸可使該活性增加。由于鹽酸組的AChE抑制活性低于對照組，表明在PDB培養基中，使AChE抑制活性增加的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。在Czapek′s培養基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可增加菌株次級代謝產物的AChE抑制活性。

對菌株YX-002[圖4(b)]而言，在PDB培養基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可降低AChE抑制活性，且酪氨酸的效果更為顯著；在Czapek′s培養基中，添加甲戊二羥酸可顯著降低菌株次級代謝產物的AChE抑制活性，而添加酪氨酸可使該活性增加。由于鹽酸組的AChE抑制活性低于對照組，表明在Czapek′s培養基中，使菌株AChE抑制活性增大的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。

Dotted boxes indicate areas of change in emphasis,arrow points to newly added or disappeared absorption peak圖2 添加前體物質前后菌株YX-001次級代謝產物的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of secondary metabolites of strain YX-001 before and after feeding precursor

Dotted boxes indicate areas of change in emphasis,arrow points to newly added or disappeared absorption peak圖3 添加前體物質前后菌株YX-002次級代謝產物的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of secondary metabolites of strain YX-002 before and after feeding precursor

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium),y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖4 菌株YX-001和YX-002次級代謝產物的AChE抑制活性Fig.4 AChE inhibitory activity of secondary metabolites of strains YX-001 and YX-002

2.2.2 DPPH自由基清除活性

對菌株YX-001[圖5(a)]而言，在PDB培養基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸可增加菌株次級代謝產物的DPPH自由基清除活性。由于鹽酸組的DPPH自由基清除活性低于對照組，說明使DPPH自由基清除活性增加的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。在Czapek′s培養基中，添加甲戊二羥酸對菌株次級代謝產物的DPPH自由基清除活性無明顯變化，而添加酪氨酸可增加DPPH自由基清除活性。鹽酸組的DPPH自由基清除活性高于對照組，且與酪氨酸前體組效果基本一致。由此推測，在Czapek′s培養基中使DPPH自由基清除活性增加的可能是鹽酸，而不是酪氨酸。

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium)，y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖5 菌株YX-001和YX-002次級代謝產物的DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH free radical scavenging activity of secondary metabolites of strains YX-001 and YX-002

對菌株YX-002[圖5(b)]而言，在PDB培養基中，添加甲戊二羥酸可降低菌株次級代謝產物的DPPH自由基清除活性，而添加酪氨酸可提高該活性。與對照組相比，鹽酸組對菌株的DPPH自由基清除活性具有抑制作用，表明在PDB培養基中，使菌株YX-002 DPPH自由基清除活性增大的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。在Czapek′s培養基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸均可增加菌株次級代謝產物的DPPH自由基清除活性。但鹽酸組的DPPH自由基清除活性增加量大于酪氨酸組，由此推測該條件下使菌株YX-002 DPPH自由基清除活性增大的原因在于鹽酸，而不是酪氨酸。

2.2.3 鹵蟲致死活性

對菌株YX-001[圖6(a)]而言，在PDB培養基中，添加甲戊二羥酸和酪氨酸可增加菌株次級代謝產物的鹵蟲致死活性。由于鹽酸組的鹵蟲致死活性低于對照組，說明酪氨酸的加入是鹵蟲致死活性增加的原因。在Czapek′s培養基中，添加甲戊二羥酸后菌株次級代謝產物的鹵蟲致死活性無明顯變化，而添加酪氨酸可使該活性明顯增加。綜上表明，添加前體物質甲戊二羥酸和酪氨酸可能會增加菌株YX-001次級代謝產物的鹵蟲致死活性。

對菌株YX-002[圖6(b)]而言，在PDB培養基中，添加前體物質甲戊二羥酸和酪氨酸對菌株次級代謝產物的鹵蟲致死活性均具有一定的降低作用；在Czapek′s培養基中，添加甲戊二羥酸可降低菌株次級代謝產物的鹵蟲致死活性，添加酪氨酸可使鹵蟲致死活性顯著增加。在Czapek′s培養基中，與對照組相比，鹽酸組對菌株次級代謝產物的鹵蟲致死活性具有抑制作用，表明使菌株YX-002次級代謝產物鹵蟲致死活性增大的原因在于酪氨酸，而不是鹽酸。

x-y is sample number,x represents medium (1 represents PDB medium,2 represents Czapek′s medium),y represents added precursor or solvent (1 for mevalondihydroxy acid,2 for hydrochloric acid and 3 for tyrosine).**** indicates comparison with the control group,P<0.000 1圖6 菌株YX-001和YX-002次級代謝產物的鹵蟲致死活性Fig.6 Artemia lethal activity of secondary metabolites of strains YX-001 and YX-002

3 討論

自20世紀60年代末開始，海洋微生物次級代謝產物作為一種新的活性物質來源，其相關研究越來越受到國內外海洋科技工作者的重視，并且由于基因工程、DNA重組、發酵工程等生物技術的發展，使得近20年來從海洋微生物中分離得到的次級代謝產物逐年增加[15]。而作為海洋微生物重要組成部分的海洋真菌，因其種類繁多，次級代謝產物類型豐富等優勢而受到廣泛的關注[16]。2019年共報道了1 490個新化合物，其中來源于海洋真菌的新化合物占將近一半(47%)，并且每年新發現的海洋真菌次級代謝產物數量仍在逐年上升，海洋真菌已成為海洋活性次級代謝產物的主力軍[17]。據文獻報道，產活性物質的真菌多來自青霉屬Penicilliumsp.、擬青霉屬Paecilomycessp.、曲霉屬Aspergillussp.、木霉屬Trichodermasp.、腐質霉屬Humicolasp.、毛殼菌屬Chaetomiumsp.、鏈格孢屬Alternariasp.、枝孢屬Cladosporiumsp.等[17]。

目前對青霉屬和藍狀菌屬Talaromycessp.真菌的研究主要集中于利用傳統方式對其次級代謝產物的分離鑒定與生物活性初步篩選評價[18-21]，而通過改變培養條件、化學誘導或基因敲除等方式挖掘微生物次級代謝產物的生物合成基因簇，使之產生更多具有較好活性的次級代謝產物的文獻報道仍然較少。陳夏雨等[22]采用單菌多次級代謝產物(OSMAC)策略對1株采自南海深海沉積環境的白黃筍頂孢霉屬真菌AcrostalagmusluteoalbusSCSIO F457進行化學多樣性的初步研究，通過在不同培養基、pH與鹽度條件下對菌株進行培養調控，篩選出2種適宜條件進行小規模發酵培養，最終從發酵產物中共新增分離鑒定11個單體化合物。陳海立[23]以兩株三七內生真菌(PreussiaisomeraXL-1326和TalaromycespurpureogenusXL-025)為研究對象，分別使用8種不同培養基小規模發酵，通過比較其次級代謝產物的合成能力，選取下一步擴大發酵的最佳培養基，最終共分離得到30個具有較好抗植物病原真菌、抗耐藥性致病細菌等藥理活性的單體化合物。Wang等[24]在真菌Penicilliumcitreonigrum的發酵過程中添加濃度為50 μmol/L的DNA甲基化酶抑制劑5-azaC，結果發現菌絲體形態與對照組相比發生了很大變化，而且通過HPLC分析發現，激活后的菌株產生了10個新色譜峰，進一步對其次級代謝產物分離純化后得到2個新的萜類化合物(atlantinone A和atlantinone B)。上述研究表明，通過改變培養條件或添加誘導劑等方式，可使目標菌株的次級代謝產物發生變化，使之產生更多活性豐富、結構獨特的化合物。

楊葉肖槿由于具有強大的增強記憶功效和抗氧化、抗炎等活性，是潛在的AChE抑制劑先導化合物來源[25]。目前，國內外對紅樹植物楊葉肖槿的研究主要集中在植物本身的化學成分及藥理活性上，尚未見對其來源內生真菌的次級代謝產物及生物活性的有關報道。本研究首次探究了添加不同前體物質對楊葉肖槿內生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002的次級代謝產物的影響。研究結果表明，除菌株YX-001在PDB培養基條件下，添加酪氨酸前體后其次級代謝產物的產量和化學多樣性降低外，其余情況均能增加2株菌株次級代謝產物的產量和化學多樣性，但生物活性的變化有所不同。同時，本研究發現酸性環境可能會促進具有較好DPPH自由基清除活性的次級代謝產物的生成，但其具體機制還有待進一步研究。部分實驗現象并沒有達到明顯變化的預期效果，可能有兩種原因：(1)菌株前體物質選擇不合適。由于次級代謝產物在生物體內合成途徑的復雜性，其中可能含有多種結構類型的活性化合物，這些化合物并不是單純的以甲戊二羥酸或酪氨酸為前體，而是以更復雜的組合形式或者由它們的復合途徑作為前體，從而導致實驗現象變化不明顯，具體的結論有待后續進一步探索。(2)發生變化的次級代謝產物本身比較微量或者痕量，而主產物的產量過大，導致其實驗現象變化不明顯，因此在后期實驗中可以考慮擴大規模培養或去除主產物，進而探究添加前體物質對那些微量次級代謝產物的影響。

4 結論

本研究表明，添加甲戊二羥酸和酪氨酸前體物質對2株菌株次級代謝產物的產量和化學多樣性整體具有較好的促進效果，但對AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性等生物活性在不同條件下的影響有較大差異。同時發現，酸性環境可能會促進具有較好DPPH自由基清除活性的次級代謝產物的生成，但其具體機制的確定還有待進一步研究。本研究為深入研究楊葉肖槿內生真菌Talaromycessp.YX-001和Penicilliumsp.YX-002的次級代謝產物奠定了基礎。