電針干預對膝骨關節炎大鼠滑膜結構和SIRT1/HMGB1信號通路的影響*

黃文韜，李 冰△，陳 恒，李 武，李朵朵

(1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005，2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種涉及膝骨變性并累及周圍組織(特別是滑膜組織)的退行性關節疾病，發病機制復雜，其中慢性低度炎癥是驅動關節退化的主要原因之一[1]。隨著人口老齡化的加劇，KOA在臨床中的發病率逐年上升，發病率已經增加到45%，在老年人中高達80%，致殘率約53%，嚴重影響人類的生活質量[2]。KOA的發生發展是一個長期慢性的不可逆過程，常采用保守治療和手術治療，尚無特效藥，在傳統中醫中認為KOA病在筋骨，電針作為中醫藥的特色治療法，已經被證實在KOA的保守治療方面發揮良好的療效，但作用機制尚不明確。臨床KOA患者大多表現出明顯的滑膜炎癥，減少炎癥介質(白細胞介素、腫瘤壞死因子)的積聚與釋放，可以減輕KOA所致膝骨紅腫、疼痛等癥狀，滑膜炎癥可能是關節破壞的重要因素[3]。沉默信息調節因子2相關酶1(sirtuin，SIRT1)在滑膜細胞炎癥反應中扮演重要角色，其高表達可降低高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和促炎因子的表達，增加滑膜細胞的壽命[4-5]。本研究在以往的研究基礎上，以SIRT1激動劑為對照，探討電針干預對KOA模型大鼠滑膜SIRT1/ HMGB1信號通路表達的影響，以期為臨床治療KOA提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 32只SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質量約(200±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗生產許可證號[SCXK(湘)2019-0004]，在湖南省中醫藥研究院實驗動物中心[SYXK(湘)2020-0008]飼養，實驗程序根據湖南省中醫藥研究院實驗動物中心管理規定進行，允許大鼠在恒定溫度、濕度和光暗循環(20～25℃；55±10 %；12 h/12 h明暗光照循環，自由飲水和攝食。

1.2 實驗試劑 SRT2104(批號：SC0272)，碧云天生物技術有限公司；IL-1β ELISA試劑盒(批號：E-EL-R0012c)、IL-6 ELISA試劑盒(批號：E-EL-R0015c)，Elabscience公司；SIRT1抗體(批號：60303-1-1g)，proteintech公司；HMGB1抗體(批號：66525-1-1g)，proteintech公司；HRP標記山羊抗大鼠(批號：G0001-2L)，Servicebio公司。SIRT1、HMGB1和β-actin引物，上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 SDZ-ⅡB型華佗牌電子針療儀(蘇州醫療用品廠有限公司，中國)，Envision2105型酶標儀(PE公司)；ChemiDoc MP 型全能型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；ABI7500型實時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)；DYY-6C型電泳儀(中國北京六一)；D3024R臺式高速冷凍離心機(DRAGONLAB，中國)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與分組[6]大鼠適應性喂養5 d后，隨機分為正常組、模型組、電針組、SIRT1激動劑組(SRT2104，25mg/kg)，每組8只。除正常組外，其余各組參考文獻誘導KOA模型：3%戊巴比妥鈉(2 mg/kg)腹腔注射麻醉，分別在造模的第1、4、7 d，于左膝關節間隙處注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，然后按壓1 min，來回屈伸關節使藥液吸收，右膝不做處理。以Lequesne MG評分評估膝骨關節炎功能障礙程度，并判斷造模是否成功。

1.3.2 干預方法 在模型復制成功后第3 d，將SD大鼠固定在鼠板上，參照《實驗針灸學》[7]選取穴位位置：內膝眼、外膝眼、陰陵泉穴，采用華佗牌針0.25 mm×25 mm進行針刺，穴位深度3～5 mm，針柄處連接華佗牌SDZ-ⅡB型電子針療儀，電流輸出強度1 mA，疏密波型，刺激10 min/次，每日1次，連續14 d；對照組給予相同時間相同時長的固定。激動劑組[8]腹腔內注射SIRT1激動劑SRT2104溶液(采用10%DMSO生理鹽水稀釋至2.5 mg/mL，2 mL)，從實驗第1 d開始，每周注射2次。正常組腹腔注射2 mL 10%DMSO生理鹽水溶液。

1.3.3 行為學測試 Lequesne MG評分包括4個指標之和：①局部疼痛度(無疼痛0分，患肢收縮1分，收縮伴輕度全身反應2分，收縮伴重度全身反應3分)；②步態改變度(正常行走0分，輕度跛行1分，跛行明顯2分，患肢不參與行走3分)；③關節腫脹度(無腫脹0分，輕度腫脹1分，重度腫脹2分)；④關節活動度(活動角度>90°0分，活動角度45°～90°1分，活動角度15°～45°2分，活動角度15°3分)。以此，評價膝骨關節炎損傷嚴重程度。

1.3.4 樣本采集 行為學評估結束后，采用3%戊巴比妥(2 mg/kg)麻醉大鼠，大鼠膝骨關節處注入1 mL生理鹽水收集大鼠膝關節滑膜液，-80℃保存待用；然后剖取膝骨關節滑膜組織，每組中4只浸泡于固定液(4%多聚甲醛)，保存待用；剩余組織置于凍存管中，保存于-80℃。

1.3.5 Elisa法檢測膝關節滑膜液IL-1β和IL-6的含量變化 取凍存的關節滑膜液，梯度解凍后，將試劑盒平衡至室溫，按照試劑盒說明書檢測膝關節滑膜液IL-1β和IL-6的含量變化。

1.3.6 HE染色檢測膝關節滑膜組織形態學變化 大鼠膝關節組織在固定液中固定15～20 d后，常規石蠟包埋，切片，制作成4 μm厚的石蠟切片，脫蠟、蘇木素和伊紅染色，封片，光學顯微鏡下觀察膝關節滑膜組織形態學變化。

1.3.7 Western-blot法檢測膝關節滑膜組織SIRT1和HMGB1表達變化 取凍存的膝關節滑膜組織100 mg，加入RIPA裂解液1 mL和100 μL PMSF溶液(1 mmol/kg)，低溫勻漿，靜置30 min，離心(12000 r，5 min，4 ℃)取上清液，采用核酸蛋白溶度儀測定總蛋白的濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，封閉，加入SIRT1和HMGB1蛋白和內參蛋白β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗孵育，ECL試劑顯影，成像系統獲取條帶圖像，Quantity One軟件定量分析蛋白相對表達水平。

1.3.8 RT-PCR法檢測膝關節滑膜組織SIRT1和HMGB1基因表達變化 取上述凍存的海馬組織，加入1 mL Trizol，低溫下勻漿，裂解5 min，提取樣本總RNA，核酸蛋白測定儀定量。按照逆轉錄反應試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA，反應條件為2× SYBR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL。擴增條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃ 10 s，60℃ 30 s，72 ℃ 2 min，40個循環。以GADPH為內參，反應結束后以2-ΔΔCt法計算分析目的基因SIRT1和HMGB1 mRNA相對表達水平。引物序列：SIRT1：Forward：5′-TCTCCCAGATCCTCAAGCCAA-3′，Reverse：5′-TGTCCGGGATATATTTCCTTTGC-3′，93bp；HMGB1：Forward：5′-GTCCACACACCCTGCATATTG-3′，Reverse：GTCCTCAGGTAAGGAGCAGAAC-3′，213bp；β-actin：Forward：5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，Reverse：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′，223 bp。

2 結果

2.1 電針對大鼠膝骨關節行為學的影響 各組大鼠造模后和治療后Lequesne MG評分如表1所示，造模后，與正常組比較，其余各組大鼠左膝關節局部疼痛腫脹與活動度增加、步態改變顯著，Lequesne MG評分總分明顯升高(P<0.01)，提示模型復制成功。干預后，與模型組比較，電針組和SIRT1激動劑組可改善大鼠左膝關節腫脹與活動度、局部疼痛、步態，Lequesne MG評分總分明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠干預前后膝骨關節行為學比較

2.2 電針對大鼠膝骨關節滑膜液IL-1β和IL-6含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠膝關節滑膜液中IL-1β和IL-6含量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，電針組和SIRT1激動劑組大鼠膝關節滑膜液中IL-1β和IL-6含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3 電針對大鼠膝骨關節滑膜組織形態病理學的影響 正常組大鼠膝骨關節滑膜上皮組織形態正常，滑膜細胞排列有序，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠膝骨關節滑膜上皮組織嚴重增生，滑膜細胞核大深染，排列不整齊，可見彌漫大量炎性細胞；電針組和激動劑組膝骨關節滑膜上皮組織輕微增生，滑膜細胞核染較淺，可見少量散在炎性細胞。

正常組

2.4 電針對大鼠膝骨關節滑膜組織SIRT1和HMGB1蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠膝關節滑膜組織中SIRT1蛋白相對表達量明顯降低，HMGB1蛋白相對表達量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，電針組和SIRT1激動劑組大鼠膝關節滑膜組織中SIRT1蛋白相對表達量明顯增加，HMGB1蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖2，表3。

A.正常組 B.模型組 C.電針組 D.SIRT1激動劑組

表3 各組大鼠膝骨關節滑膜組織SIRT1和HMGB1蛋白相對表達量比較

2.5 電針對大鼠膝骨關節滑膜組織SIRT1和HMGB1mRNA表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠膝關節滑膜組織中SIRT1mRNA相對表達量明顯降低，HMGB1mRNA相對表達量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，電針組和SIRT1激動劑組大鼠膝關節滑膜組織中SIRT1mRNA相對表達量明顯增加，HMGB1mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠膝骨關節滑膜組織SIRT1和HMGB1mRNA相對表達量比較

3 討論

膝骨關節炎在傳統中醫屬于痹證范疇，稱之為“骨痹”、“膝弊”等，與外感風寒濕邪和(或)年長體衰勞損等導致肝腎虧虛、經脈閉阻有關，治療多從筋論治，調衡筋經陰陽氣血、疏利關節[9]。針灸可通過經絡、腧穴的傳導作用內病外治，在臨床治療KOA中不僅可以有效調節疼痛中樞，改善微循環，還能避免藥物治療時的不良反應，提高了治療的安全性[10]。位于膝關節之髕骨下兩側的內膝眼穴和外膝眼穴，具有“通經活絡，消腫止痛”之功，再配以“清利濕熱、益腎調經”的陰陵泉穴，在治療KOA發揮良好的作用。本研究選取以上穴位，予以現代與傳統相結合的電針刺激，明顯改善大鼠膝關節腫脹、活動度、局部疼痛與步態。

KOA疾病早期即觀察到滑膜的慢性炎癥反應，其可導致血管形成增加、關節炎性浸潤疼痛、腫脹僵硬等，抑制滑膜細胞增殖和炎性因子釋放，可有效控制關節變形，減緩KOA病程。膝骨滑膜主要由內膜常駐巨噬細胞和成纖細胞構成，與下層血管化結締組織等構成了滑膜液的主要成分，對于維持正常軟骨和關節功能發揮重要作用[11]。SIRT1是一種NAD+依賴性III類蛋白脫乙酰酶，可抑制細胞代謝凋亡、炎癥反應等，促進各類細胞存活。有研究發現，SIRT1參與KOA滑膜炎癥發展，低表達能夠導致促炎癥因子的釋放，增加血管裔的生成，減少軟骨細胞的存活率[12]。此外，SIRT1激動劑能夠減少Ⅱ型膠原誘導的關節炎模型大鼠滑膜細胞中IL-1β的表達，有效緩解滑膜炎癥[13]。

HMGB1是炎癥反應的重要警報器，當機體受到炎癥侵襲時，其賴氨酸殘基乙酰化，然后釋放至胞質或胞外參與炎癥信號級聯反應。臨床研究顯示，關節炎患者血清和滑膜液中HMGB1的表達明顯升高，并與病情的發展成正相關，是關節軟骨損傷的標志蛋白；HMGB1還能與IL-1形成復合體，促進KOA大鼠模型滑膜成纖維細胞釋放相關促炎因子，并加速關節軟骨的降解[14-15]。SIRT1是乙酰化/去乙酰化修飾的上游調節劑，可以通過去乙酰化作用調節HMGB1的釋放，從而減弱炎癥介質(IL-1β、IL-6等)的釋放[16]。SIRT1過表達能夠抑制脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7細胞HMGB1乙酰化和核質易位[17]。SIRT1新型激動劑SRT2104，能減輕葡聚糖硫酸鈉(DDS)誘導的結腸炎模型中的炎癥，還能顯著減弱LPS誘導的IL-6釋放[18]。

本研究選用激動劑SRT2104和電針干預KOA大鼠模型，發現其能有效改善滑膜炎性浸潤和損傷，減少滑膜液中炎性因子(IL-1β和IL-6)的釋放，調控滑膜組織中SIRT1和HMGB1蛋白基因的相對表達，因此，我們有理由認為SIRT1/ HMGB1信號通路在KOA的發生與發展中扮演重要角色。電針作為一種綠色療法已經在臨床KOA的治療效果中被肯定，本研究為其提供更加科學和深入的理論支撐。