叢枝菌根真菌對白刺花苗期抗旱酶系及生理特性的影響

田 方,陳 錫,,鐘 理,李 巖,王普昶,

(1.貴州大學 生命科學學院/農業生物工程研究院，山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室，貴州省農業生物工程重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省農業科學院，貴州省草業研究所，貴陽 550006)

白刺花(Sophoradavidii)是豆科槐屬多年生灌木或小喬木。它具有抗逆性強、適應性廣、適口性好、營養價值高、水土保持能力強等優良特性，是干旱、貧瘠地區的節水抗旱先鋒植物，被廣泛應用于畜牧業[1-3]；該植物還是一種民間草藥，已被證明是類黃酮、生物堿、類固醇、木脂素和酚酸的豐富來源，其根、葉、花和果實用于治療腹瀉、膀胱炎、胃痛、水腫和疥癬等疾病[4-6]。貴州槐屬植物種質資源較為豐富，具有極高的觀賞價值、藥用價值和生態防護等用途。然而貴州是典型的喀斯特山區，地表裸露著大面積的碳酸鹽、石漠化和水土流失嚴重、旱災頻發，但喀斯特山區水熱條件好，適合灌木、草本植物生長，充分合理利用地理條件優勢，開展對槐屬植物白刺花抗旱栽培技術研究，建立草地農業生態循環系統，對喀斯特山區生態恢復具有重要的實際應用價值[7-8]。

叢枝菌根是球囊菌門真菌與植物根系形成的互惠共生體。相關研究表明約80%的陸地植物與AMF存在共生現象[9]。寄主植物通過光合作用合成碳源，并將其傳送給AMF，提供菌絲生長和孢子發育所需營養和能量，同時AMF幫助寄主植物吸收礦質養分，促進植物生長發育，氣孔開閉、滲透調節和抗氧化保護系統等一系列生理生化反應，誘導植物提高對逆境脅迫的抗性[10]。AMF與植物共生互作一直是菌根領域的研究重點內容之一，在增強植物抗旱性、提高對高低溫的耐受性、增強耐鹽及耐酸能力、緩解重金屬對植物的毒害，以及提高植物抗病性和抗蟲性等方面有著重要作用[11-12]，而其中有關AMF提高植物抗旱性的報道較多，如干旱條件下柑橘(Poncirustrifoliata)接種AMF后發現菌根吸水能力提高2～7倍，顯著提高了植株的抗旱能力[13]；烤煙(NicotianaL.)幼苗侵染AMF后，煙苗氮、磷、鉀含量增加及抗旱性大幅提升[14]；構樹幼苗接種AMF后可以緩解干旱脅迫對幼苗生長和光合參數的影響，提高其抗旱性[15]。施用AMF可以提高植物抗旱性，發揮作用的大小因菌劑種類、施用方式及實施對象具有一定差異[16-18]。岳海等[19]對澳洲堅果幼苗接種土著AMF后發現植株根系的定植能力更強，抗旱性增強；許慶龍等[20]對南高叢藍莓接種4種AMF后發現植株根、莖、葉的磷和鉀含量以及根圍土壤酸性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性增加，尤以侵染摩西球囊霉菌時抗旱效果最佳。另外在小麥(TriticumaestivumL.)、任豆 (Zeniainsignis)和西紅柿(Lycopersiconesculentum)等作物中普遍發現接種AMF能提高宿主植物的抗旱性[16-18]。

目前，對干旱脅迫下AMF與白刺花抗旱性的相關研究鮮有報道。本研究對干旱處理后白刺花幼苗施用3種種屬和4個濃度梯度的AMF，測定白刺花葉片過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide disimutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、谷胱甘肽S-移換酶(glutathione S-transferase，GST)等酶活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，還測定淀粉、可溶性糖和纖維素等生理生化指標，探究AMF對白刺花苗期抗旱酶系及生理特性的影響，并進行綜合評價，篩選出最優AMF菌株及最適濃度，為喀斯特山區白刺花節水抗旱調節措施提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗材料為貴州省草業研究所審定品種‘盤江白刺花’(Sophoradavidii(Franch.) Skeels)，種植于貴州省草業研究所溫室大棚內[光照強度為 700 μmol·m-2·s-1，溫度為(20±5) ℃，光照14 h，黑暗10 h，濕度為60%] 。

1.1.2 供試菌種 供試菌種為根內球囊霉1株(Glomusintraradices，BEG Number 193，簡稱 BEG-193)，幼套球囊霉1株(Glomusetunicatum，BEG Number 168，簡稱BEG-168)，摩西球囊霉1株(Glomusmosseae，BEG Number 167，簡稱BEG-167)。3株菌種由貴州大學山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室惠贈。試驗前經高粱(SorghumbicolorL.) Moench)擴繁后得到由孢子、菌絲、菌根節段和培養基質組成的菌劑。

1.2 材料處理

選取籽粒飽滿、大小均一的白刺花種子，自來水沖洗2 h，浸泡24 h。用75%的酒精浸泡 1 min，蒸餾水沖洗3～4次，然后用84消毒液浸泡2 min，蒸餾水沖洗3～4次，置于30 ℃恒溫箱中催芽。待種子自然萌發后采用育苗穴盤(上口徑60 mm；底部28 mm；深度53 mm)進行育苗，選取長勢一致且無病蟲害的幼苗。試驗共設空白對照CK(未接種處理接等量滅菌真菌接種物)+3種AMF接種物(培養基質、孢子、菌根根段和菌絲作為接種物)，每種真菌分別設置3個濃度梯度10%、20%、40%(對應每處理分別施用20、40、 80 g菌劑)。將滅菌的基質裝入塑料花盆中，每盆裝入供試基質(營養土+蛭石)和相應濃度的真菌接種物，共0.2 kg。每個處理生物學重復10次。前期正常澆水，進行緩苗處理，緩苗生長15 d后，根據葉片特征變化，自然狀態下連續干旱處理10 d后測定其葉片生理生化指標。

1.3 生理生化指標測定

選取白刺花植株中上部、受光較一致的第 3～7片功能葉，擦凈表面污漬后用液氮速凍，置于-80 ℃保存，備用。按SOD抑制氮藍四唑(NBT)光化還原法[21]測定葉片超氧化歧化酶(SOD)活性；采用紫外吸收法[22]測定過氧化氫酶(CAT)活性；采用硫代巴比妥酸法[23]測定丙二醛(MDA)含量；采用愈創木酚法[24]測定過氧化物酶(POD)活性；采用蒽酮法[21]測定可溶性糖、纖維素和淀粉含量。每處理3次生物學重復，每個重復3個技術重復。

1.4 數據處理

采用 Excel 2010 軟件進行數據統計和作圖，用 SPSS 24.0軟件進行相關性分析和單因素方差分析(ANOVA)并通過Duncan氏法在α= 0.05時進行多重比較。對所測樣本的數據進行相關性分析、主成分分析，采用隸屬函數分析法綜合評價3種AMF對白刺花抗旱性的影響[25]。

2 結果與分析

2.1 AMF對白刺花表型特征的影響

干旱脅迫下接種不同種類、不同濃度AMF，白刺花表型表現出明顯差異(圖1)。在適宜濃度的AMF處理下白刺花葉片長勢良好,干旱癥狀明顯減弱，對照(CK)則表現出葉片明顯萎蔫卷曲，葉尖和葉基出現焦枯甚至出現植株死亡等癥狀，表明AMF可能具有提高白刺花抗旱能力的作用。

A.摩西球囊霉菌；B.幼套球囊霉菌；C.根內球囊霉菌

2.2 AMF對白刺花抗旱酶系的影響

由表1可知，在干旱脅迫下，接種不同種類的AMF后白刺花葉片的抗氧化酶和解毒酶活性顯著上升(P<0.05)。接種40%根內球囊霉菌，CAT和POD酶活最高，與未接種相比差異顯著；接種40% 幼套球囊霉菌時，SOD和GST酶活最高，上升幅度最大，差異達到顯著性水平。由試驗結果可知，接種適宜濃度的AMF可以極大的提高白刺花葉片的CAT、POD、SOD和GST酶的活性，有效的緩解干旱脅迫對白刺花葉片造成的氧化損傷。

表1 干旱脅迫下AMF對白刺花抗旱酶系的影響Table 1 Effect of AMF on drought-resistant enzymes of Sophora davidii under drought stress

2.3 AMF對白刺花生理指標的影響

由圖2可知，干旱脅迫處理下，施用3種不同濃度的AMF后白刺花葉片的淀粉、可溶性糖、纖維素和MDA含量發生顯著性變化(P<0.05)，接種40%幼套球囊霉菌時，淀粉含量最高，增長58.2%，與對照相比有顯著性；當接種40%摩西球囊霉菌時，可溶性糖含量最高，提高25.3%，差異顯著；接種20%根內球囊霉菌時，纖維素含量最多，增加45.5%，與未接種相比有顯著性差異；當接種20%幼套球囊霉菌時，MDA含量最低，差異達到顯著水平。以上結果表明，施用適宜濃度的AMF可以顯著提高白刺花葉片淀粉、可溶性糖和纖維素含量，降低MDA含量，以此來降低干旱脅迫帶來的傷害。不同菌株和不同濃度的AMF在不同抗旱指標上各有優勢和劣勢，很難判斷各濃度AMF的總體抗旱水平，因此要對各AMF的抗旱指標進一步分析，進行綜合評價。

不同大寫字母表示同一濃度處理下不同AMF間差異顯著，不同小寫字母表示同一AMF不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.4 干旱脅迫下白刺花葉片各抗旱指標的相關性分析

對干旱脅迫下白刺花的生理生化指標進行相關性分析，結果由表2可知，在淀粉、CAT、GST、POD和SOD中，任意2個指標之間均呈現極顯著正相關(P<0.01)，其中淀粉與GST的相關系數最大為0.808，而淀粉與CAT的相關系數最小為0.596；而MDA與淀粉、CAT、GST、POD、SOD、可溶性糖、纖維素之間呈現極顯著負相關(P<0.01)，其中最大系數為0.760，最小為0.525。8個抗旱指標之間都存在一定的相關性，說明干旱脅迫下對白刺花施加AM真菌使其提高抗旱能力是由多方面因素綜合決定的。

表2 白刺花葉片各抗旱指標相關性分析Table 2 Correlation analysis of drought resistance indexes of Sophora davidii leaves

2.5 干旱脅迫下白刺花葉片各抗旱指標主成分分析

將白刺花幼苗的8個綜合抗旱指標數據進行主成分分析，由KMO和Bartlett檢驗結果得KMO 為0.790，大于0.5的標準；顯著性為 0.000，小于顯著水平0.05，適用于主成分分析方法。根據各主成分的特征值和貢獻率進行主成分提取，由表3可知特征值大于1的主成分有2個，第一主成分的特征值為5.053，方差貢獻 63.16%，第二主成分的特征值為1.067，方差貢獻13.33%。兩個主成分累積貢獻率達到 76.50%，可將前2個主成分的指標作為AM真菌耐旱處理的綜合評價指標。

表3 白刺花葉片各抗旱指標特征值和累積方差貢獻率Table 3 Eigenvalues and cumulative variance contribution rate of each drought resistance index of Sophora davidii leaves

由表4可知，除了MDA對第一主成分產生負向影響外，其余的指標均產生正向影響，載荷數都比較高，POD最高，為0.944；對第二主成分產生負向影響的指標有可溶性糖和纖維素，載荷數為-0.071和-0.713，正載荷指標中淀粉最高，為載荷值0.355。

表4 白刺花葉片各抗旱指標主成分荷截得分矩陣Table 4 Principal component charge cut-off score matrix of drought resistance index of Sophora davidii leaves

2.6 不同濃度的AMF對白刺花幼苗生長抗旱酶系和生理指標的綜合評價

對白刺花幼苗施加不同種屬和不同濃度的AMF，使其增強應對干旱脅迫的能力，為了科學地評價AMF對白刺花抗旱性的影響，篩選最佳的菌種和濃度，采用隸屬函數綜合評價法，分別計算出各濃度菌種接種后，白刺花的抗旱指標的隸屬函數值，把各項指標的隸屬函數值累加，取其平均值。隸屬函數均值越大，AMF提高白刺花的作用效果越明顯。由表5可知，3個菌種的平均隸屬函數值為0.168～0.847，菌種間差異較大，其中幼套球囊霉菌的抗旱性最佳。施用不同濃度的3種真菌，白刺花抗旱效果排序依次為：40% BEG- 168>40% BEG-193>20% BEG-168>20% BEG-193>10% BEG-168>40% BEG-167>20% BEG-167>10% BEG-167>10% BEG-193>CK，結果顯示：接種40%幼套球囊霉菌時抗旱效果最佳。

表5 白刺花幼苗抗旱指標的隸屬函數綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation of subordination function of drought resistance indexes of Sophora davidii seedlings

3 討 論

干旱是限制喀斯特山區植被生長的主要原因之一，白刺花作為喀斯特山區廣泛分布的灌叢群落優勢種，已成為干旱、貧瘠地區水土保持和飼料行業的理想材料[26-27]，而AMF與植物的共生關系又可有效提高對干旱逆境的耐受性[10]，因此研究AMF與白刺花幼苗共生對干旱脅迫的適應策略，對喀斯特地區飼料資源開發和生態植被恢復都具有重要的理論與實踐指導意義。

在長期的進化過程中，植物通過一系列特征變化、生理生化響應等機制，以緩解干旱脅迫帶來的損害[28]。如植物體內的抗旱酶(SOD、POD、CAT和GST)主要是通過促進H2O2分解為分子氧和水，清除體內過量的過氧化產物和脂質氫過氧化物，以防止ROS(reactive oxygen species，不完全還原的氧，自由基和非自由基)過度積累而導致細胞損傷和死亡。CAT、POD、SOD和GST是植物體內主要的抗環境脅迫的酶系，通過它們的變化程度可以反映植物的抗逆性。本研究中白刺花幼苗接種3種AMF后均表現出較高酶活性，說明AMF侵染能有效清除脅迫下產生的有害活性氧自由基，降低脅迫帶來的傷害。許慶龍等[20]對南高叢藍莓接種四種AMF后，發現葉片SOD活性均顯著高于未接種株，其中以摩西球囊霉菌的抗旱效果最佳；劉兆娜等[29]研究發現，百合混合接種摩西球囊霉和地表球囊霉菌種后生長加快，植株體內CAT、POD和SOD活性提高。接種不同菌株的AMF抗氧化酶的變化程度不同，說明白刺花在不同環境中對過氧化物積累和過氧化物清除能力有差異，這與鮑根生對小花棘豆(OxytropisglabraDC)接種叢枝菌根真菌后的研究結果類似[30]。MDA作為植物細胞膜脂過氧化的產物，植物受到氧化傷害的程度越小體內積累MDA量越少[31-32]。鄧杰等[33]研究發現，AMF的存在可以緩解逆境脅迫對植物造成的傷害，接種AMF后在一定程度上不僅能促進植物生長、磷吸收以及光合作用的進行，提高抗氧化酶活性，還能降低丙二醛(MDA)濃度。本研究發現AMF侵染白刺花后，丙二醛(MDA)濃度顯著低于對照，植株受到的氧化傷害降低，這與鄧杰等[33]研究結果類似。

在生理生化適應性方面，AMF共生是植物應對干旱脅迫環境的重要途徑[34]，表現為：增加土壤水分攝取，增強植物吸收水分的能力；提高抗氧化酶活性，降低氧化損傷；調節內源激素和滲透壓平衡、促進植物吸收養分；增加葉綠色含量，促進光合效率，提高宿主植物抗逆性[35-38]。本研究中接種摩西球囊霉菌能顯著提高白刺花葉片滲透調節物質可溶性糖含量，改變植物糖代謝水平，以維持細胞的滲透勢，增強細胞的保水能力，從而增強白刺花對干旱脅迫的耐受性。Wu等[39]在干旱條件下接種AMF也顯著提高枳(PoncirustrifoliaL.)葉片中滲透調節物質含量，進而增強其抗旱性；劉兆娜等[29]在干旱條件在對百合接種AMF后發現，可溶性蛋白、可溶性糖含量分別比對照提高了25%和46%，減輕膜脂氧化的傷害，增強非酶促防御系統能力，增強植物細胞的抗旱能力。而淀粉和纖維素作為植物體內重要碳水化合物和能量儲存體，當遭遇干旱脅迫時，植物體內的淀粉和纖維素可能會分解成糖類來抵御逆境，以維持滲透壓平衡，增強植株耐旱性，以保持正常的生命活動[40-41]。本試驗中干旱條件下接種AMF后，白刺花幼苗的淀粉和纖維素的含量顯著高于對照(P<0.05)，從而增強植株對干旱脅迫的耐受性。這與孫悅燕等[42]對干旱條件下華北落葉松幼苗接AMF后研究結果相似。

本研究采用隸屬函數綜合評價法，評價了不同菌株和濃度的AMF對白刺花幼苗生理生化抗旱指標的影響，在一定程度上宏觀清晰地得出各濃度菌株綜合評價值。但在實際應用中，由于受到不同品種、生長環境和干旱程度不一致等情況的影響，結果可能存在著一定的局限性，因此需要對植株的生境進行全面考慮，針對性地選擇適宜濃度的AMF。

4 結 論

干旱條件下對白刺花施加適宜濃度的AMF能提高白刺花葉片的滲透調節物質含量、抗旱酶活性，降低葉片的MDA含量，提高淀粉和纖維素含量以改變糖代謝水平，提升白刺花的抗旱性。綜合分析比較不同AMF處理對干旱條件下白刺花幼苗抗氧化酶和生理特性的影響發現，3種AMF對白刺花幼苗的抗旱提升效果排序依次為幼套球囊霉菌>根內球囊霉菌>摩西球囊霉菌，且在施用濃度40%的幼套球囊霉菌時抗旱效果最佳，為白刺花節水抗旱栽培技術研發及AMF的推廣應用提供科學理論依據。