放牧藏綿羊瘤胃熱休克蛋白70家族基因表達特征及其與微生物的互作研究

呂衛兵，牛 彬，沙玉柱，魏 紅，史 浩，胡 江，王繼卿，李少斌，羅玉柱，劉 秀

(甘肅農業大學 動物科學技術學院/甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，蘭州 730070)

藏綿羊主要分布在青藏高原地區，是青藏高原最古老、特有的原始綿羊品種，為當地牧民提供了肉、毛、皮等生活物品，是當地不可或缺的經濟動物[1]。瘤胃是反芻動物消化系統中最重要的消化器官，可以實現飼草的高效消化與吸收；也是反芻動物免疫系統的重要組成部分，其中瘤胃上皮屏障在抵御疾病的過程中發揮著重要作用[2]。瘤胃內含有大量的微生物，瘤胃微生物在飼草發酵和宿主能量供應過程中發揮著重要作用[3]，可以通過分解纖維素和半纖維素等宿主不能直接利用的物質，從而為宿主提供能量和營養物質[4]；除此之外，腸道微生物可以促進初始B細胞的分化、激活B細胞的多種TLR(Toll like receptor)配體，增加B細胞存活、抗原呈遞和抗體產生，進而調控宿主的免疫系統[5]；腸道微生物還可以直接通過其代謝物(短鏈脂肪酸、膽汁酸和色氨酸等)參與宿主免疫代謝過程[6-7]。由于青藏高原獨特的自然環境和氣候條件，牧場的天然牧草在5月初開始發芽，10月初開始枯萎，枯草期牧草的粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)等營養物質含量顯著下降[8]。而藏綿羊在漫長的枯草期(10月至翌年4月)通過啃食枯草維持機體的基礎代謝并維持種群繁衍[9-10]，這與瘤胃微生物的協同進化作用有密不可分的聯系。

熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSP)是一類對于維持細胞穩態至關重要的分子伴侶，在細胞應對各種環境脅迫的過程中起著重要的保護作用[11]。熱休克蛋白70(HSP70)是目前研究最為廣泛的HSPs家族，它作為一種細胞內源性保護蛋白，當機體或細胞遭受應激時，可以通過一系列的表達調控機制使表達量顯著增加，并在一定的范圍內通過維持機體或細胞的生理功能穩態來抵御或減緩應激對細胞的損傷[12]，除此之外HSP70還在抗細胞凋亡和調節免疫反應等方面發揮著重要的調控作用[13]。其中，HSPA1A和HSPA8是HSP70家族最重要的組成部分[14]，且共同參與細胞凋亡過程，促進HSP70抗凋亡性質的發揮[15]；HSPA1A可通過抑制細胞凋亡因子(如FAS和BAX)，促進抗細胞凋亡因子(如BCL2)，發揮其抗細胞凋亡的特性[16-17]；HSPA8作為促進蛋白質折疊的伴侶蛋白，不僅有助于細胞各種功能活動[18]，還具有調控腫瘤細胞干性和免疫調節功能[19-20]。青藏高原除了高寒、缺氧、紫外線強等環境特點外，冬季晝夜溫差大、短暫強降溫以及長期寒冷環境刺激是造成藏綿羊生理機能失衡、導致免疫力和生產性能等下降的重要因素[21]。有研究報道，放牧藏綿羊瘤胃古菌種群(優勢菌群)多樣性隨著牧草中結構性碳水化合物含量的升高而增大[22]。也有研究發現，藏綿羊瘤胃微生物與其代謝產物存在相關性，并通過影響瘤胃上皮相關基因活性調控其適應性[23]。因此，本研究對不同時期放牧藏綿羊瘤胃組織熱休克蛋白70家族基因(HSPA1A、HSPA8)的表達特征及其瘤胃微生物菌群結構進行分析，探究不同時期宿主基因與微生物菌群在青藏高原特殊環境條件下的互作機制，為藏綿羊放牧管理、品種選育以及疾病預防提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與樣品采集

試驗樣本選取于甘肅省甘南藏族自治州合作市佐蓋曼瑪鄉(海拔3 300 m)牧戶藏綿羊群體中，羊群采用傳統自然放牧模式，且不進行任何補飼。分別在4月、6月、10月和12月進行樣品采集，每個時期選擇年齡相近(12±1月齡)，體質量相近(35.12 kg±1.43 kg)以及健康狀況良好的藏綿羊母羊6只，在羊只歸牧后的次日早晨利用羊用胃管式瘤胃采樣器采集瘤胃液(n=24)，取適量分裝于凍存管中，編號后儲存于液氮中，以供后續16S rRNA分析。在采集每只羊的瘤胃液之前均需用蒸餾水將采集裝置的管道和容器沖洗干凈，防止樣品之間的交叉污染。隨后，從每個時期的6只藏綿羊母羊中隨機選取3只進行頸部動脈放血屠宰(n=12)，立即解剖并選取瘤胃腹囊部位剪取適量組織，用4 ℃預冷的生理鹽水和PBS緩沖液沖洗干凈，用吸水紙吸干多余的水分，分裝于1.5 mL離心管中，編號后迅速儲存于液氮罐中，帶回實驗室后在-80 ℃保存，用于后續的RNA提取。

1.2 瘤胃組織總RNA提取及cDNA合成

每份瘤胃組織樣品分別取100 mg，用Trizol提取瘤胃組織總RNA，然后將提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，再通過蛋白核酸測定儀檢測RNA的純度和濃度，全部樣品的吸收比(A260/A280)為1.8～2.1。最后通過gDNAwiper酶的反轉錄試劑盒進行cDNA的合成。

1.3 引物設計及合成

以β-actin為內參基因，用Premier 5.0對HSPA1A和HSPA8基因進行引物設計，引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 熒光定量分析

以β-actin為內參基因，利用熒光定量PCR儀器(ABI Q6)進行熒光定量。反應條件：95 ℃預變性30 s；循環反應：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；每次循環的最后一步收集SYBR green熒光信號，溶解曲線(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。反應體系：20 μL體系，含有2XChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，cDNA模板和上下游引物。以β-actin作為內參基因進行 校正。

1.5 瘤胃微生物DNA提取及高通量測序

利用細菌DNA提取試劑盒MN NucleoSpin 96 Soi(Omega，中國上海)對24個瘤胃液樣本(每個時期6個樣本量，共4個時期)進行瘤胃液微生物組DNA的提取。編碼細菌核糖體RNA的核酸序列保守區主要是16S區，使用通用引物(正向引物338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和反向引物806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因高變區的V3～V4區進行PCR擴增，采用兩步建庫法對瘤胃微生物進行建庫測序，將擴增產物在Illumina MiSeq 2500(Illumina,San Diego,CA,USA)平臺進行建庫測序分析。對 Reads 拼接過濾、質控評估后，基于Silva(細菌)分類學數據庫對OTU進行分類學注釋，獲得各樣品在屬水平上的微生物群落信息。

1.6 數據分析

HSPA1A和HSPA8的相對表達量采用2-ΔΔCT的計算方法進行計算，最終試驗數據用“平均值±標準差”表示；使用SPSS 22.0軟件對數據進行分析，采用單因素方差分析，顯著性水平為0.05。將瘤胃微生物的屬水平豐度排名前20的物種與基因表達量進行相關性分析，采用Spearman 的方法進行計算，Spearman 相關系數閾值為0.1，顯著性P值為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同時期藏綿羊瘤胃熱休克基因表達特征分析

如圖1所示，不同時期藏綿羊瘤胃HSPA1A和HSPA8基因相對表達量存在顯著性差異。其中HSPA1A在6月的表達量顯著高于4月(P<0.05)，極顯著高于10、12月(P<0.01)，且6月的表達量分別是10月、12月的4.21倍和11.86倍；HSPA8在6月的表達量極顯著高于12月(P<0.01)，且6月的表達量分別是10月、12月的2.93倍和9.19倍。

圖中不同小寫字母表示同一基因在不同時期的表達量存在顯著性差異(P<0.05)。下同

2.2 不同時期瘤胃微生物菌群特征分析

2.2.1 瘤胃微生物組成及多樣性分析 本研究對不同時期的24個樣品進行16S rRNA測序，共獲得1 919 292對 Reads，雙端Reads質控、拼接后共產生1 835 963 條Clean Reads，每個樣品至少產生73 683條Clean Reads，平均產生76 498條Clean Reads。稀釋性曲線(圖 2-A)可知，在 20 000 reads處曲線趨于平緩，即樣本中的物種并不會隨測序數量的增加而顯著增多，測序覆蓋比較全面，測序數據可靠性高，可進行后續的分析。根據Venn圖(圖 2-B)可見，不同時期藏綿羊瘤胃微生物共有978個OTUs，4月、6月、10月和12月特有OTU分別為14、4、3和1個。通過PCoA分析發現(圖 2-C)，不同分組的樣品聚類明顯，不同分組微生物之間存在明顯差異。

圖2 稀釋性曲線 (A)、OTU分布 (B)和PCoA分析(C)Fig.2 Dilution curve(A)，OTU distribution(B) and PCoA analysis(C)

由表2可知，瘤胃微生物測序共獲得1 223個OTU，并且測序覆蓋率達到99.6%以上，其中，4月有952個，6月有819個，10月有1030個，12月有948個。由Shannon指數可知，4月和10月顯著高于其他時期(P<0.05)，即4月和10月的物種多樣性顯著高于其他時期；ACE和Chao1指數均在10月顯著高于其他時期(P< 0.05)，即10月的物種豐富度顯著高于其他時期。

表2 2 Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis

2.2.2 不同時期瘤胃微生物組成變化及差異性分析 在不同分類學水平，門水平共檢測出17個物種，屬水平共檢測出149個物種。在門水平(圖3-A)，Bacteroidetes和Firmicutes在每個時期所占相對豐度的比例均最高，兩者之和占總豐度的83.3%以上，其中，Bacteroidetes占53.4%以上，Firmicutes占27.4%以上，為優勢菌門。Patescibacteria的豐度比例在不同時期均高于1%，且在不同時期間存在顯著差異(P<0.05)。根據ANOVA(圖3-C)進一步分析可知，門水平共有14個組間差異物種；豐度最高的Bacteroidetes在12月顯著高于6月和10月(P<0.05)；Firmicutes豐度在6月顯著高于4月和12月(P< 0.05)。屬水平物種組成如圖3-B所示，其中，Prevotella_1、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae _R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Prevotellaceae_UCG-001、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcus_1和uncultured_bacterium_f_F082在每個時期相對豐度均大于1%；其中Prevotella_1(18.2%以上)、Rikenellaceae_RC9_gut_group(9.2%以上)在每個時期豐度比例均最高，為優勢菌屬。149個屬中共鑒定出108個差異物種(P<0.05)，根據ANOVA(圖3-D)進一步分析可知，Rikenellaceae_RC9_gut_group在12月顯著高于其他時期(P<0.05)，Succiniclasticum和Butyrivibrio_2在6月顯著高于其他時期(P<0.05)。

* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。下同

2.3 瘤胃微生物與宿主基因相關性分析

將不同時期HSPA1A和HSPA8的表達量與對應時期的瘤胃微生物(屬水平豐度排名前20的物種)進行相關性分析，由相關性熱圖(圖4)可知，HSPA1A、HSPA8與瘤胃微生物存在一定的相關性(P<0.05)。其中HSPA1A與Ruminococcaceae_NK4A214_group、Butyrivibrio_2、uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Prevotella_1、Succiniclasticum存在顯著正相關，與Prevotellaceae_UCG-003、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R-7_group、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Prevotellaceae_UCG-001存在顯著負相關；HSPA8與uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、Succiniclasticum、Ruminococcaceae_UCG-005、Prevotella_1、Ruminococcaceae_NK4A214_group存在顯著正相關，與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R-7_group、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Prevotellaceae_UCG-001存在顯著負相關。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

當動物遭受應激時，細胞會顯著提高熱休克蛋白的水平來抵抗應激對細胞的損傷[23]。一般來說，冷應激對動物免疫系統功能的影響主要是抑制性的。有研究發現HSP70表達量的增加，表明機體已遭受應激性損傷，從而提高機體的自我保護機能，以便增強對外界不良刺激的抵抗力[24]。HSPA1A是應激誘導性HSP70家族中最具有代表性的伴侶蛋白，此類蛋白在正常生理狀態下不表達或低表達[25]。本研究中HSPA1A和HSPA8在不同時期瘤胃中的表達量存在顯著差異，其中6月表達量顯著高于10月和12月。青藏高原牧場中青草期(6月至8月)牧草營養含量(粗蛋白)高于返青期和枯草期，且生物量在8月達到巔峰[26]；永結[27]研究發現，藏綿羊免疫力在青草期達到峰值，可以有效抵御外來抗原的入侵，但在枯草期和返青期免疫力低下，發病率增加。這與本研究結果一致，即藏綿羊瘤胃的免疫力在6月增強，而牧草的營養含量的升高在一定范圍會提高藏綿羊瘤胃免疫力。

高原反芻動物的營養攝入模式隨季節變化而變化，牧草的營養成分以及環境變化對宿主腸道微生物組成有顯著影響[28]，在影響瘤胃菌群結構的眾多因素中，飲食是最重要的[29]。本研究中不同時期瘤胃微生物菌群豐度與多樣性存在顯著差異，這與不同時期牧草營養成分的變化有關。Bacteroidetes的成員可以將飼料中蛋白質和碳水化合物有效分解為SCFAs，為宿主提供能量[30]，還可以促進瘤胃的生長和瘤胃體積的增加[31]；Rikenellaceae_RC9_gut_group參與降解植物來源的多糖[32]，其相對豐度隨著飼草纖維含量的增加而增加[33]，本研究中，Bacteroidetes、Rikenellaceae_RC9_gut_group在12月顯著高于6月和10月，其主要功能是降解枯草期牧草中的多糖，更徹底地分解牧草，為機體提供更多的能量。Firmicutes可以促進VFAs可以轉化為葡萄糖，并促進瘤胃上皮細胞對葡萄糖的吸收，防止瘤胃酸中毒[31]，Succiniclasticum可將琥珀酸鹽轉化為丙酸；Butyrivibrio_2屬于纖維分解菌，在瘤胃中對降解纖維素物質產生VFAs起著關鍵作用[34-35]；本研究中，Firmicutes、Succiniclasticum和Butyrivibrio_2在6月顯著高于4月和12月，其主要功能是在青草期防止瘤胃酸中毒而轉運更多的VFAs，也進一步為宿主提供更多的能量。Kim等[36]研究發現低海拔家畜瘤胃微生物中Bacteroidetes(31%)顯著低于Firmicutes(56%)；而本研究所有時期的Bacteroidetes(53.5%)豐度顯著高于Firmicutes(27.4%)，即青藏高原藏綿羊瘤胃中Bacteroidetes在牧草分解和能量供應過程中發揮著更加重要的作用。Prevotella_1的豐度與飲食營養的變化有關(如蛋白質和淀粉的減少可導致Prevotella_1豐度的降低)[37]，也與丙酸的產生有關[38]；Christensenellaceae_R-7_group主要分解纖維物質[39]。相關性分析發現，不同時期藏綿羊瘤胃微生物與HSPA1A和HSPA8存在一定的相關性，其中HSPA1A和HSPA8與Prevotella_1、Succiniclasticum存在顯著正相關，與Rikenellaceae_RC9_gut_group、Christensenellaceae_R-7_group存在顯著負相關；即瘤胃微生物在一定程度上可以對宿主的免疫功能產生影響，且HSPA1A和HSPA8的表達與牧草營養成分含量呈正比，與纖維素含量呈反比。

4 結 論

不同時期放牧藏綿羊瘤胃上皮HSPA1A和HSPA8表達量以及瘤胃微生物菌群豐度和多樣性均存在一定差異，青草期(6月份)熱休克蛋白表達量顯著升高，從而導致其免疫力6月份顯著升高；而微生物菌群結構隨著不同時期環境的變化，其微生物多樣和豐度發生顯著變化，主要體現在一些與纖維物質降解、能量相關的差異微生物的變化，其目的是徹底分解牧草以達到對牧草的充分利用，為宿主提高更多的能量。進一步相關性分析發現，不同時期差異微生物與宿主上皮基因之間存在一定的相關性，表明瘤胃微生物在一定程度上可以對宿主的免疫功能產生影響。