益坤飲對卵巢去勢大鼠血壓的影響及其作用機制研究

李苗苗 詹 群

（南京中醫藥大學附屬南京中醫院，江蘇南京 210022）

《中國心血管健康與疾病報告2020》顯示，中國心血管病死亡占城鄉居民總死亡原因的首位，而絕經后女性因激素水平變化患心血管疾病風險增加，預防高血壓的發生為心血管健康管理零級預防策略[1]。因此，有效預防絕經后女性血壓升高的發生對于降低絕經后女性心血管疾病患病風險也尤為重要。研究表明，雌激素能夠提高抗氧化物水平并增加抗氧化酶的活性，絕經后的雌激素水平低下增強了體內氧化應激[2-6]。在氧化應激增強狀態下，外周循環中增多的活性氧簇（ROS）可誘導炎性因子分泌，導致內皮炎癥反應增強，造成內皮損傷，引起血管內皮中內皮素、血栓素A2等收縮因子升高，血管收縮增強，從而引起血壓升高。此外中樞內增多的ROS引起的氧化應激通過刺激延髓頭端腹外側（the rostral ventrolateral medulla，RVLM）區 交 感神經元，引起交感神經興奮性傳出增加，導致血壓升高[7-10]。

益坤飲為江蘇省名中醫陳霞教授治療圍絕經期綜合征的經驗方，前期研究顯示益坤飲能夠調節下丘腦-垂體-卵巢性腺軸，提升圍絕經期女性血清雌二醇（E2）水平，調節神經遞質，有效改善圍絕經期低雌激素水平問題[11]。圍絕經期氧化應激與低雌激素相關，因此本研究制作卵巢去勢（ovariectomized，OVX）大鼠，以RVLM區氧化應激情況為切入點，觀察益坤飲抗氧化作用以及對OVX大鼠血壓的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物35只健康SPF級雌性SD大鼠購自南京青龍山實驗動物中心，體重180～200g。大鼠飼養于恒溫（21～23 ℃）、恒濕（45%～65 %）的飼養室，保持12 h明暗循環，自由進食飲水。本實驗遵循美國國立衛生研究院動物護理和使用指南，并經南京中醫藥大學倫理委員會審核通過（202206A045）。

1.2 藥物與主要試劑益坤飲由南京中醫藥大學附屬南京中醫院藥劑科制劑室制備。藥物組成：熟地黃10g、枸杞子10g、白芍10g、生牡蠣15g、鉤藤15g、合歡皮10g、黃芪10g、茯苓10g、淫羊藿10g。藥物制備為生藥濃度1.7g/mL的濃縮液，臨用前用蒸餾水配成0.34g/mL、0.68g/mL兩種濃度的藥液（按生藥量計）。

替勃龍片（荷蘭歐加農公司生產，南京歐加農制藥有限公司分包裝，原藥批號615557001，分裝批號：LE-0991-10），規格：2.5 mg/片，臨用前用研缽研碎后用蒸餾水配成0.25 mg/mL的溶液（按制劑量計算）。

超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（索寶來，批號：BC0175），丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（索寶來，批號：BC0025），煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）活性檢測試劑盒（Abcam，批號：ab51254/UOTR1B493），去甲腎上腺素（NE）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（茁彩，批號：ZC-37121）。RIPA強裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B、P0010）；膜再生液（Solarbio，批號：SW3022）。

1.3 主要儀器智能無創鼠尾動脈血壓測量儀（日本軟隆有限公司，型號：BP-98A）；全波長酶標儀、低溫離心機（Thermo，型號：Multiskan Sky、Fresco17/17R）；電泳及轉模系統（Bio-Rad，型號：1658033）；高通量組織勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：Scientz-48）；凝膠成像系統（上海天能科技有限公司，型號4600）。

2 實驗方法

2.1 造模雌性SD大鼠在無菌條件下麻醉后于下腹正中作一長約1.5 cm的豎切口，逐層切開皮膚、筋膜、腹膜，見子宮呈“Y”字形，周圍有脂肪組織包繞；用眼科顯微鑷提起子宮底，沿輸卵管找到雙側卵巢；止血鉗鉗夾卵巢根部，結扎后完整切除雙側卵巢。術后予肌注青霉素20 000 U/kg，連續3 d。術后第5天開始陰道涂片，連續7 d，陰道涂片顯示性周期紊亂即提示OVX造模成功。

2.2 分組與給藥取7只雌性SD大鼠作為假手術組，手術方法、術后處理同2.1部分，但進入腹腔后不切除卵巢。造模成功的OVX大鼠隨機分為模型組、陽性藥物組和益坤飲高、低劑量組，每組7只。陽性藥物組每日按0.25 mg/kg灌胃給予替勃龍溶液，益坤飲低、高劑量組每日分別按3.4g/kg、6.8g/kg灌胃給予益坤飲濃縮液（其中高劑量相當于人體給藥劑量），假手術組與模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，各組均連續灌胃30 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 血壓測定末次給藥12 h后，各組大鼠使用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，通過股動脈監測血壓，血壓穩定30 min后開始記錄收縮壓、舒張壓。

2.3.2 ELISA法檢測尿去甲腎上腺素（NE）含量各組大鼠完成血壓測定后當天開始，采用代謝籠法收集大鼠24 h尿量，加入冰醋酸作為防腐劑，并置于-20 ℃低溫冰箱保存待測。采用ELISA法檢測各組大鼠尿NE含量。

2.3.3 RVLM組 織ROS、SOD、MDA水 平 檢 測尿液收集完成后，放血處死大鼠，迅速在冰面上將各組大鼠腦組織中延髓取出，按照第3版Paxinos＆Charles Watson大鼠腦圖譜，確定RVLM的基本位置。分離RVLM核團區，轉移到Eppendorf離心管中，置于-80 ℃冰箱避光保存待測。取出組織標本，投入液氮中，置于-80 ℃冰箱中制成冰凍切片，組化筆畫圈，圈內滴入ROS染液，避光孵育30 min，DAPI復染細胞核，避光孵育10 min，封片，于熒光顯微鏡下觀察圖像，記錄熒光讀數。ELISA法檢測各組大鼠RVLM組織SOD、MDA含量。

2.3.4 蛋白質印跡法（Western Blot法）檢測RVLM組織NOX4蛋白表達各組隨機取3只大鼠的RVLM組織各50 mg，研磨分裝于離心管中，加入250 μL的RIPA裂解液勻漿（使用前5 min加入蛋白酶抑制劑），4 ℃過夜裂解，提取蛋白。根據蛋白定量結果，加入蛋白樣品及裂解液，輕輕混合后95 ℃變性10 min。制備SDS-PAGE凝膠，依次進行蛋白上樣、電泳、轉膜，將轉移膜置于封閉液中，封閉后的膜放入一抗兔抗人NOX4（封閉液1∶1000稀釋），4 ℃孵育過夜，將反應膜放入平皿中洗膜，放入二抗羊抗兔（封閉液1∶5000稀釋），室溫下孵育1 h。用ECL顯色后，置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達，用Image J軟件對各抗體條帶的灰度值進行統計，計算蛋白的相對表達量。

2.4 統計學方法采用Graphpad Prism 7對數據進行統計學分析。本研究所有計量資料均符合正態分布，以（±s）表示。2組間數值比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠血壓比較與假手術組比較，模型組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠收縮壓均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；益坤飲高、低劑量組大鼠收縮壓均顯著高于陽性藥物組（P＜0.05，P＜0.01），益坤飲高劑量組大鼠收縮壓明顯低于低劑量組（P＜0.01）。在舒張壓方面，各給藥組大鼠與模型組比較，各給藥組之間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠血壓比較（±s） 單位：mmHg

表1 各組大鼠血壓比較（±s） 單位：mmHg

注： 與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。1 mmHg≈0.133 kPa。

3.2 各組大鼠RVLM組織ROS、SOD、MDA水平比較與假手術組比較，模型組大鼠RVLM組織ROS、MDA水平顯著升高（P＜0.01），SOD含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠RVLM組織ROS水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽性藥物組、益坤飲高劑量組大鼠RVLM組織MDA含量顯著降低（P＜0.01），SOD含量顯著升高（P＜0.01）。陽性藥物、高劑量益坤飲對上述指標的改善顯著優于低劑量益坤飲（P＜0.01），陽性藥物組與益坤飲高劑量組上述指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠RVLM組織ROS、MDA、SOD水平比較（±s）

表2 各組大鼠RVLM組織ROS、MDA、SOD水平比較（±s）

注： 與假手術組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。

3.3 各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達比較見圖1、表3。與假手術組比較，模型組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；益坤飲高劑量組、陽性藥物組大鼠RVLM組織NOX4水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），且均顯著低于益坤飲低劑量組（P＜0.01）。

圖1 Western Blot法檢測各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達

表3 各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠RVLM組織NOX4蛋白表達比較（±s）

注： 與假手術組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。

3.4 各組大鼠尿NE含量比較與假手術組比較，模型組大鼠尿NE含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組、益坤飲高劑量組大鼠尿NE含量顯著降低（P＜0.01）。益坤飲各劑量組大鼠尿NE含量顯著高于陽性藥物組（P＜0.01），其中高劑量組顯著低于低劑量組（P＜0.01）。詳見表4。

表4 各組大鼠尿NE含量比較（±s）

表4 各組大鼠尿NE含量比較（±s）

注： 與假手術組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△△P＜0.01；與益坤飲低劑量組比較，▲▲P＜0.01。

4 討論

《素問·至真要大論》記載：“諸風掉眩，皆屬于肝。”由此可認為，血壓的波動主要責之于肝。腎藏精，肝藏血，精聚為髓，精髓化生為血（精血同源），肝腎同源于精血。女性一生經孕產乳耗傷精血，故女子發病多由“真陰不足”所致。女子七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，腎精虧虛，故而圍絕經期肝腎陰分不足。陰分不足，肝陽上亢，故絕經后女性易發生血壓升高的情況。益坤飲由《景岳全書》中“歸腎丸”化裁而來，方中君藥熟地黃、枸杞子、白芍滋陰補腎、養血柔肝；鉤藤清降心肝郁火，生牡蠣平肝潛陽、重鎮安神，合歡皮行氣解郁除煩，共為臣藥；淫羊藿補腎陽，于陽中求陰，為佐藥；黃芪、茯苓健脾益氣，后天氣血以養先天，又以茯苓化痰利濕助運，可防止補益藥滋膩礙胃，均為使藥。全方共奏滋腎養陰、平肝寧心之功。

NADPH氧化酶，即還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，是中樞神經系統內活性氧的主要來源，其中NOX4是大腦中含量最豐富的NOX同系物，是催化生成ROS的關鍵酶[12-14]。NOX4表達上調會產生大量的ROS，ROS與其他物質發生氧化反應時會產生MDA。MDA作為脂質過氧化的產物，其含量反映了體內氧化應激的情況，MDA含量升高說明氧化應激增強。SOD是體內重要的抗氧化酶，可分解清除機體有害氧自由基，起到抗氧化的作用[15]。本研究結果表明，模型組大鼠RVLM組織NOX4、ROS、MDA水平較假手術組顯著升高，SOD含量顯著下降，說明OVX大鼠RVLM組織氧化劑抗氧化平衡被打破，存在氧化應激增強。

RVLM區包含了幾乎所有的運動前交感神經血管收縮神經元，控制脊髓外側角的交感神經節前神經元。同時，本研究觀察到模型組大鼠尿NE含量、收縮壓較假手術組顯著升高。因此我們認為，RVLM區氧化應激增強而致交感中樞神經元活性增強，導致交感信號流出[14]，交感神經系統活性亢進引起血壓升高。

研究顯示雌激素可通過降低RVLM區氧化應激抑制交感亢進從而改善大鼠絕經后的心血管功能[6]。孫嫘等[16]研究發現針刺人迎穴可提高自發性高血壓大鼠RVLM區抗氧化能力，降低交感神經活性從而有效緩解高血壓癥狀。本研究結果表明，益坤飲各劑量組大鼠RVLM組織ROS及NOX4水平較模型組下降，收縮壓較模型組下降，差異均具有統計學意義，說明益坤飲可通過降低NADPH氧化酶降低RVLM組織活性氧水平從而影響收縮壓。本研究發現，與模型組比較，高劑量益坤飲及陽性藥物替勃龍均能顯著上調RVLM組織SOD水平，降低RVLM組織ROS、MDA水平以及尿NE含量，因此我們推測高劑量益坤飲及替勃龍能夠有效提高中樞抗氧化能力，降低中樞氧化應激，減弱交感神經元活性，降低交感神經亢進，從而控制OVX大鼠收縮壓的升高。因激素替代存在一定的副作用及遠期風險，2018年中國絕經管理與絕經激素治療指南指出不推薦僅為預防心血管疾病而采用激素替代[17]，因此中醫藥用于預防絕經后心血管疾病有較高的研究價值。

本研究中針對交感亢進的情況評估僅進行了尿液NE測定，后期研究可進行RVLM區交感神經活動記錄，進一步明確益坤飲對RVLM交感輸出的影響，為益坤飲預防心血管疾病的發生提供科學依據。