食品中蠟樣芽孢桿菌檢測技術應用進展

◎ 種 婷

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽 110032）

1 蠟樣芽孢桿菌的危害

蠟樣芽孢桿菌是一種產芽孢的革蘭氏陽性桿菌，是一種條件致病菌，自然界中廣泛存在，其產生的內生孢子對外界不良環境有很強的抵抗力，對高溫、酸堿不敏感[1]。蠟樣芽孢桿菌分為產毒株和不產毒株，不產毒株是一種有益菌，被用于植物種植和動物飼養，但產毒株卻給食品安全和人們的身體健康帶來了嚴重的危害[2-3]。

2017年，中國疾病預防控制中心衛生應急中心發布的食物中毒事件數據顯示，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件占食物中毒事件總數和中毒總人數的1.72%（6/348）和3.63%（268/7 389），僅次于細菌性食物中毒、沙門氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌腸毒素，位列第五[4]。2017—2019年，遼寧省共采集12類4 694份樣品進行食源性致病菌檢測分析，蠟樣芽孢桿菌在第二季度檢出率最高為16.92%[5]。2018—2020年，寶雞采集轄區內12個縣區6類食品187份樣品進行檢測分析，結果檢出33株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為17.65%[6]。在腐乳[7]、嬰幼兒食品[8]、蜂蜜[9]、濕粉類制品[10]和米飯和肉制品[11]等食品中均檢出過蠟樣芽孢桿菌。產毒株按照食物中毒癥狀分為嘔吐型和腹瀉型兩種，其分泌的毒素耐高溫、耐高壓，在食品加工過程中不能被分解，人們誤食被其污染的食品會引起嘔吐或者腹瀉，嚴重者還會死亡[12]。由此可見，快速、準確地檢測蠟樣芽孢桿菌具有重要意義，本文對檢測蠟樣芽孢桿菌的方法進行總結概括，以期為快速檢測鑒定蠟樣芽孢桿菌提供思路，為食品安全監管提供依據。

2 免疫學檢測法

ZHU等[13]研發出一種快速檢測肉制品中蠟樣芽孢桿菌的特異性雙抗體夾心酶聯免疫吸附法。采用辛酸/飽和硫酸銨沉淀法和蛋白A-sepharose柱分別從兔抗血清和小鼠腹水中制備蠟樣芽孢桿菌特異性多克隆抗體（Polyclonal Antibody，pAb）和單克隆抗體（Monoclonal Antibodies，MAB），檢測限（Limit of Detection，LOD）為9×102CFU·mL-1。樣品中含有多種致病菌時，該方法能夠快速準確地檢測到蠟樣芽孢桿菌。酶聯免疫法的優點是高通量，但對底物顏色有要求，否則會影響結果判讀。

3 分子生物學檢測法

3.1 實時熒光PCR法

楊滴等[14]建立了一種實時熒光PCR法，檢測肉制品中蠟樣芽孢桿菌，通過對蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等20株細菌檢測，特異性良好，蠟樣芽孢桿菌檢出限為1×103CFU·mL-1。HANSEN等[15]提出一種檢測蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌腸毒素編碼基因的方法，該方法檢測HBL和NHE操縱子基因的6套引物以及用于檢測BCET的BCET1、BCET3和BCET4引物的PCR分析。

3.2 多重PCR法

劉芳等[16]采用多重實時熒光PCR法設計了與腸毒素相關的三重HBL A、HBL C、HBL D基因，非溶血性腸毒素三重NHE A、NHE B、NHE C基因，嘔吐毒素、腸毒素、細胞毒素三重CES、ENT FM、BCE T基因檢測蠟樣芽孢桿菌毒力基因。實驗結果顯示特異性較好，檢出限可達到63 CFU·mL-1。劉秀峰等[17]建立多重PCR方法同時檢測蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的HBL A、HBL C、NHE A、NHE B、CYT K、CER、ENT FM、BCE T基因和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）的CRY基因。試驗發現CRY基因可作鑒別基因用來區分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金蠟樣芽孢桿菌，大大縮短了蠟樣芽孢桿菌的檢驗周期。

3.3 環介導等溫擴增法

張童等[18]通過對5組引物進行特異性、靈敏度測試后，選出性能較好的1組引物，并對其進行優化，從而建立一種環介導恒溫擴增法檢測牛乳中的蠟樣芽孢桿菌。將蠟樣芽孢桿菌混入牛乳進行檢測，菌量在2.1×102CFU·mL-1時即可被檢出。徐曉可等[19]建立針對嘔吐毒素CES B基因檢測蠟樣芽孢桿菌的環介等溫擴增法（Loop-mediated Isothermal Amplification ，LAMP），特異性強，靈敏度為5.0×103CFU·mL-1。采用此法檢測被蠟樣芽孢桿菌污染的食品，當蠟樣芽孢桿菌菌量超過103CFU·g-1時即可被檢出。賈雅菁等[20]采用實時熒光與環介導等溫擴增技術相結合的方式，對蠟樣芽孢桿菌溶血素HBL A基因進行鑒定，該方法比普通環介導等溫擴增法靈敏度高10倍，靈敏度可達 8.2 CFU·mL-1。

3.4 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法

ULRICH等[21]等用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法對121株芽孢桿菌（m/z為800～1 800 Da）進行測量，使用ClinProTools 3.0統計軟件和Flex分析軟件（德國Bruker Daltonics GmbH），評估兩種特定的生物標記物（m/z分別為1 171 Da和1 187 Da），可以區分嘔吐型和非嘔吐型蠟樣芽孢桿菌，識別正確率為99.1%。KRZYSZTOF等[22]采用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜分析完整細胞，對嘔吐型和非嘔吐型蠟樣芽孢桿菌進行鑒定。34株蠟樣芽孢桿菌嘔吐型菌株和88株非嘔吐型菌株（包括蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、魏氏芽孢桿菌和類霉菌芽孢桿菌）的系統蛋白質組聚類顯示，兩組之間的相似性水平為43%，且嘔吐型菌株之間有高度相關性（相似性為78%）。

4 結語

蠟樣芽孢桿菌傳統方法檢驗周期長，檢驗過程復雜煩瑣，且對檢驗員的能力與經驗要求高。酶聯免疫吸附法特異性強，高通量，檢測周期短，所需儀器設備僅為一般實驗室常備儀器，缺點是不能實時檢測。實時熒光PCR操作簡單，檢測時間短，由于蠟樣芽孢桿菌毒力基因多，僅對其中一個毒力基因進行檢測準確率低，有假陽性和漏檢的情況。多重PCR可同時檢測多個目標基因，檢驗效率高，但易出現交叉反應，造成假陽性。環介導等溫擴增法操作簡單，適用于現場快速檢測，引物設計時要關注其特異性，否則易導致非特異性擴增。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜是近年來新興的一種以蛋白質指紋圖譜為基準的鑒定方式，具有鑒定時間短、通量高、后續費用低等特點，但所用儀器設備價格昂貴，對其發展有所制約。以上檢驗方法各自有優缺點，應根據實際檢測要求選擇合適的檢測方法，從而使每種檢測方法的優點最大化。