微生物快速檢測技術研究進展

◎ 韓金龍，閔武瓊，葉富饒，王 琴，董 梅，趙 璐

（1.渭南市檢驗檢測研究院，陜西 渭南 714000；2.渭南初級中學，陜西 渭南 714000；3.渭南市市場監督管理局，陜西 渭南 714000）

食品質量和安全控制需要在食品加工關鍵點進行實時監控，快速準確的分析方法是保證產品質量符合標準和安全的先決條件。在食品和飼料生產加工過程中，快速檢測腐敗細菌、病原體和其他微生物污染物對降低腐敗事件的發生概率和確保安全的食品供應至關重要。微生物生長是食物腐敗最常見的原因，可能表現為肉眼可見的菌落生長，組織質地變化或產生異味。食品的微生物腐敗是一個重要的經濟損失和浪費問題，全球預計有33%的糧食損失源于微生物腐敗。微生物污染的快速檢測和識別有助于制定有針對性的控制措施，以遏制微生物通過食品加工地區的傳播。世界范圍內每年約有6億人因食用微生物污染食品而患病，42萬人因此死亡，微生物污染一度成為全球最重要的食品安全問題。近年來，微生物快速檢測方法的研究進展受到廣泛關注。根據主要原理，這些快速檢測方法可分為基于微生物核酸的檢測、基于免疫學方法和基于生物傳感器的方法3類。

1 核酸檢測方法

微生物的核酸具有高度的種間特異性，以微生物核酸為靶點檢測食品病原體的最大優勢是高特異性，通過將待檢微生物中的核酸序列與一個合成的互補核苷酸序列雜交來檢測，根據其使用的方法可以分為以下4種方法。

1.1 PCR

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前最常用、最成熟的檢測微生物的核酸擴增技術。對于特定的物種，對引物擴增出的核酸序列進行測序比對，很容易實現病原微生物的特異性檢測。相比于傳統的生化鑒定法，PCR法優勢在于高特異性、快速、靈敏，基于此原理開發的食品病原體檢測方法已得到廣泛的開發利用[1]。PCR也可用于毒素檢測，主要是通過擴增編碼細菌毒素的特定基因實現檢測。

1.2 多重PCR

同時擴增多個位點從而在一個反應中快速檢測多個微生物，被稱為多重PCR（mPCR）檢測方法。而引物設計是mPCR的關鍵難題，多個引物之間可能存在相互作用，因此可能需要調整引物濃度、PCR條件等因素，以產生足夠的用于分析的核酸序列。如今，mPCR還可以用來定義某些微生物群落的結構，并評估群落動態，如發酵過程中或對環境變化的響應。

1.3 定量PCR

定量PCR（qPCR）是一種能夠在整個反應過程中連續監測PCR產物形成的方法。它提供了目標基因的快速、同步擴增和序列特異性檢測，并越來越多地應用于微生物檢測[2]。使用該方法可以定量食品中的特定微生物，并通過研究合適的目標基因的表達，研究其在環境（食品成分、溫度、pH值和O2等）影響下的行為。同時，該過程的實時監測意味著無需對樣品進行凝膠電泳等擴增后處理，減少了分析時間。

1.4 恒溫擴增技術

雖然PCR法已廣泛應用于各種微生物基因組檢測，但其需要多個熱循環來分離擴增雙鏈DNA。在過去的20年里，許多新的方法已經發展到在等溫條件下擴增核酸包括環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、依賴核酸序列的擴增技術（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）、滾環擴增（Rolling Circle Amplification，RCA）和鏈置換擴增術（Strand Displacement Amplification，SDA）。恒溫擴增的硬件要求比PCR低，不需要熱循環系統，甚至可以使用簡單的水浴裝置進行擴增。

LAMP是一種高效、低成本、簡便、高靈敏度和高特異性的檢測方法，廣泛應用于微生物檢測領域。該方法依賴于Bst DNA聚合酶大片段自動循環鏈置換DNA合成，與PCR不同的是，該方法主要設計4～6條引物針對靶基因的6～8個特定區域。LAMP反應通常在60 min內產生10倍或更高水平的莖環DNA擴增產物。用SYBR Green I染料代替常規凝膠電泳分析，可以用肉眼觀察LAMP產物；存在LAMP擴增序列時，溶液顏色變為綠色，不存在LAMP擴增序列時，溶液顏色仍為橙色。

NASBA是一種檢測RNA或DNA的等溫擴增反應。該反應通常由3種酶組成，包括T7 RNA聚合酶、RNase H和禽骨髓母細胞瘤病毒逆轉錄酶，以單鏈RNA為模板擴增序列。NASBA能夠特異性地針對目標RNA或DNA序列，并因其廣泛應用于臨床、環境和食品樣本的病原體檢測而日益流行。

2 免疫學方法

基于抗原-抗體結合的免疫檢測被廣泛應用于食源性病原體的檢測，這些測定主要依靠抗體與抗原的特異性結合。各種抗體已被用于不同的試驗類型，以檢測食源性病原體和微生物毒素。

2.1 酶聯免疫吸附分析

酶聯免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種應用最廣泛的檢測食源性病原體的免疫方法，也是一種非常準確和敏感的檢測抗原或半抗原的方法[3]。傳統的ELISA反應通過顯色劑和底物反應，產生某種可觀察到的顏色變化，以光吸收波長變化為檢測指標。

2.2 側流免疫層析

雖然ELISA已廣泛應用于許多實驗室，但該方法仍然需要各種設備和訓練有素的檢測人員。越來越多的基于橫向流動免疫分析的現場免疫技術，如試紙法、免疫層析法和免疫過濾法等在食品工業和醫藥中的病原體、霉菌毒素和疾病檢測領域得到了越來越多的關注。在側流免疫層析中，樣品溶解液通過毛細管作用沿固體層析介質流動。樣品的不同組分通過層析后與著色試劑結合（膠體乳膠或金顆粒標記的抗體或抗原），遇到用抗體或抗原預處理過的層析界面區域，樣品中的分析物特異性結合會展示出不同的顏色。大多數側流免疫層析在樣品層析后的2～10 min內會出現可視化顯色反應。作為一種定性檢測方法，可以實現病原微生物的快速便攜檢測。

2.3 免疫磁珠分離分析

免疫磁珠分離（Immunomagnetic Separation，IMS）是利用免疫磁珠作為捕獲試劑，針對性地捕捉病原微生物的方法。IMS原理類似于傳統的微生物選擇性篩選富集，即特異地捕獲檢測病原體，使病原體達到檢測濃度。分析過程主要包括2個基本步驟。①將目標微生物樣品與免疫磁顆粒混合孵育1 h，然后利用磁選機進行分離。②對結合免疫磁珠的微生物復合物進行多次洗滌，去除污染物。

3 生物傳感器檢測

生物傳感器包含生物材料、生物衍生材料或仿生學材料，可以是光學材料、電化學材料、溫敏材料和壓電材料等。用于病原微生物檢測的生物傳感器設備通常可以分為3部分，包括生物捕獲分子、將生物捕獲分子-靶標相互作用轉換為信號的方法以及數據輸出系統。生物傳感器最大的優點是能夠快速或實時檢測、便攜和實現多病原微生物檢測，可用于生產現場和生物實驗室分析。據報道，生物傳感器已被開發并應用于食源性病原體的微生物分析，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌以及各種微生物毒素[4]。

3.1 光學生物傳感器

光學生物傳感器是傳統分析技術的替代品，具有高特異性和高靈敏度的優勢。生物傳感器檢測通常依賴于酶系統，該系統通過催化將分析物轉化為一定產物，可在工作電極上氧化或還原，并保持在特定的電位。光學生物傳感器技術可以根據吸收、反射、拉曼、紅外、化學發光、色散、熒光和磷光等原理分為幾個亞類。在過去的10年中，各種用于快速檢測食品工業中的病原體、毒素和污染物的光學生物傳感器被開發出來。該技術的主要優點是實時檢測，而且所需儀器成本較低。

3.2 壓電生物傳感器

壓電生物傳感器能夠根據沉積質量與其頻率響應之間的線性關系，對微量的分析物進行敏感檢測，是一種有效的替代無標記光學傳感器，如表面等離子體共振光譜和干涉測量。壓電生物傳感器已得到廣泛應用，對致病菌釋放的特定揮發性有機化合物的嗅覺感應是確定食品污染的較為突出的方法之一。

3.3 免疫傳感器

基于特異性抗體-抗原相互作用的免疫傳感器是通過將反應物固定在傳感器的表面，檢測抗原與抗體相結合，將表面變化參數轉換為可檢測的電信號。由于抗原對固定化抗體的擴散限制，實時測量免疫反應較為困難，特別是對于低水平的污染物。然而，大多數免疫傳感器在20～90 min內產生結果，與傳統技術和經典的ELISA相比，免疫傳感器接近實時反應。

3.4 電化學生物傳感器

基于電化學的檢測方法是進一步基于轉導的系統，已被用于識別和定量微生物。根據觀察到的電流、電位、阻抗和電導等參數，電化學生物傳感器可分為安培響應、電位響應、阻抗響應和電導響應。為分析食源性病原體而開發的電化學生物傳感器主要使用電化學阻抗譜作為轉導技術，從而為細菌檢測提供了無需標簽、在線、高通量的設備。阻抗譜是研究導電材料及其界面的一種有效方法，通過這種技術，將一個小幅度和可變頻率的循環函數施加到換能器上，并利用產生的電流計算出每個探測頻率處的阻抗。阻抗生物傳感器是基于測量細菌細胞附著或與電極相關聯時電特性的變化檢測食源性病原體[5]。

4 結語

近年來，人們已經探索和發展了幾種快速檢測食源性病原體的方法。然而，大多數檢測方法仍然需要提高靈敏度、選擇性或準確性，才能有實際用途。檢測基質會對微生物的檢測產生重大影響，因此需要對檢測原材料基質中微生物的分離技術以及在免疫、核酸或生物傳感器檢測之前的樣品濃度進行更多的研究。盡管在過去的幾十年對食源性病原體的檢測進行了大量的研究，但目前的技術仍有改進的空間，最終目標是實現微生物高效、精準、便捷的檢測。