人參皂苷對人宮頸癌細胞相關生物學功能的影響

余瑛 張群貴 崔華子 廖振蓉 王琪 彭濤

(贛州市腫瘤醫院，江西 贛州 341000)

宮頸癌病灶發生于子宮頸鱗柱上皮的交界處，該病是當今女性最常患的婦科腫瘤性疾病，也是臨床數據統計總結出的危害女性生命安全的前列危險因素〔1〕。臨床數據提示：宮頸癌在中國的發病率有逐漸升高的趨勢，且伴有大概率的不良預后事件發生〔2～4〕。癌細胞的共同特點在于增殖失控及侵襲遷移能力較機體正常細胞顯著增強，而細胞凋亡與其增殖的相互配合關系到機體微環境穩態〔5〕，癌細胞周期不僅影響到癌細胞增殖，對癌細胞凋亡也有重要意義。人參為傳統名貴中草藥，古來有滋補元氣、安神益智及養生之功效〔6～8〕，研究證明人參皂苷Rg3是中藥人參中的主要活性成分，且其養生功效與抗腫瘤作用關系密切〔9～11〕。本研究從腫瘤細胞角度分析人參皂苷Rg3對宮頸癌細胞的殺傷抑制作用。

1 材料與方法

1.1試驗材料 人宮頸癌Hela細胞株(武漢博士德生物工程有限公司)、胎牛血清(澳洲Gibco)、青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)、人參皂苷Rg3(天津阿爾塔科技有限公司)、二甲基亞砜(美國OriGen)、Bio-red550酶標儀、流式細胞儀(上海達邁生物科技有限公司)、Transwell聚碳酸酯微孔膜、蘇木精染液(廈門研科生物科技有限公司)、電子顯微鏡(上海蒼茂實業有限公司)等。

1.2細胞培養及藥品配制 將宮頸癌Hela細胞培養于室溫條件下的基礎培養液(含10%胎牛血清、適量青霉素、鏈霉素)中，培養箱5%的CO2濃度及飽和濕度。人參皂苷Rg3首先進行甘醇溶解，試驗時通過基礎培養液稀釋至甘醇濃度低于0.01%。

1.3噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 對數生長期宮頸癌Hela細胞加入96孔板，試驗組分別加入稀釋后的人參皂苷Rg3，并使藥物終濃度至20、40、50、160、320、400 μg/ml，每組設置平行孔3個，對照組不加藥物培養。培養48 h后，各組加入MTT溶液繼續培養4 h。結束培養后，移除上清液，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)震蕩至沉淀溶解酶標儀測490 nm處OD值，計算腫瘤細胞生長抑制率，取3次重復試驗均值。以抑制率和人參皂苷Rg3濃度做曲線算IC50。生長抑制率(%)=(對照組OD值-試驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4流式細胞術分析細胞周期變化 通過MTT法檢測出人參皂苷Rg3抑制Hela細胞生長有效濃度，將對應組Hela細胞用濃度為65%的乙醇進行固定并保存。檢測前用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行洗滌，滴入PI染液避光保存30 min于流式細胞儀檢測癌細胞的周期變化。

1.5Transwell檢測細胞遷移能力 培養48 h后，收集各組腫瘤細胞于無血清培養液多次洗滌計數，每孔110個細胞接種 Transwell聚碳酸酯微孔膜，下室以完全培養基為趨化因子，顯微鏡觀察進入下室的癌細胞數，PBS 洗滌后甲醇溶液進行固定再進行蘇木素染色，顯微鏡下觀察，取隨機3個視野穿過細胞數的均值評估癌細胞遷移能力。

1.6Boyden 檢測細胞侵襲能力 將液態基質膠與無血清培養基混合后加入Transwell聚碳酸酯微孔膜，37℃放置5 h成為固態。各組細胞通過無血清培養液洗滌后以每孔110個細胞接種于固態基質膠上，余下步驟同1.5。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行直線回歸及Pearson分析、q檢驗和χ2檢驗。

2 結 果

2.1人參皂苷對宮頸癌細胞增殖的影響 試驗組宮頸癌細胞增殖抑制率較對照組均顯著上升(P<0.05)；試驗組宮頸癌細胞的增殖抑制率隨人參皂苷Rg3濃度增大而升高，藥物濃度與癌細胞增殖抑制率正向相關性(R>0，P<0.05)。見表1。

表1 各組宮頸癌細胞生長抑制情況

2.2人參皂苷對宮頸癌細胞周期的影響 160 μg/ml人參皂苷Rg3組和對照組G0-G1期宮頸癌細胞比例無明顯差異(P>0.05)；160 μg/ml人參皂苷Rg3組S期宮頸癌細胞比例較對照組顯著上升(P<0.05)；160 μg/ml人參皂苷Rg3組G2/M期宮頸癌細胞比較對照組顯著下降(P<0.05)。兩組癌細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 人參皂苷Rg3對宮頸癌細胞周期的影響

圖1 兩組宮頸癌細胞周期和凋亡

2.3人參皂苷對宮頸癌細胞遷移能力的影響 對照組癌細胞過膜個數〔(115.33±21.56)個〕較160 μg/ml人參皂苷Rg3組〔(35.23±7.34)個〕顯著升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組宮頸癌細胞遷移能力(蘇木素染色，×200)

2.4人參皂苷對宮頸癌細胞侵襲能力的影響 對照組宮頸癌細胞穿膜個數〔(90.37±12.59)個〕顯著高于160 μg/ml人參皂苷Rg3組〔(29.37±6.45)個；P<0.05〕。見圖3。

圖3 兩組宮頸癌細胞侵襲能力(蘇木素染色，×200)

3 討 論

我國宮頸癌高發年齡為50歲左右〔12〕。就當前情況而言，臨床多采用手術及放化療的治療手段來應對該類疾病，由于腫瘤疾病的發生發展過程迅速，一旦宮頸癌進入晚期確診，這對臨床治療方案的制定和實施都是一個挑戰〔13〕。因為腫瘤疾病的晚期化療方案需要加大放射的劑量，這一舉措在有效殺傷腫瘤細胞的同時，對機體正常細胞也會帶來巨大損害，使患者預后情況不佳〔14～16〕。天然中藥材富含的各種有效成分被投入臨床的研究和用藥，其優勢于治療宮頸癌中日益突出〔17～19〕。人參皂苷作為中藥人參的有效成分有緩解機體疲勞、抑制腫瘤疾病及增強人體免疫力的功效，研究表明，人參皂苷Rg3是中藥人參中抗腫瘤作用效果較佳的單體成分〔20，21〕。

本試驗提示人參皂苷Rg3是通過阻礙宮頸癌細胞的DNA合成使癌細胞滯留在分裂期之前，促進癌細胞凋亡。人參皂苷Rg3能夠通過阻礙癌細胞侵襲其他正常體細胞控制宮頸癌疾病。

綜上，人參皂苷Rg3能夠通過抑制人宮頸癌細胞的增殖，影響腫瘤細胞周期促進細胞凋亡，抑制人宮頸癌細胞的遷移和侵襲等惡性生物學功能來阻止宮頸癌發展。