MicroRNA-137增加腎細胞癌對順鉑的敏感性

艾民 桑林 王自立 張洪俠 劉寶新

(1長春大學特殊教育學院中醫系，吉林 長春 130022；吉林大學 2中日聯誼醫院體檢中心；3校醫院康復科)

腎細胞癌(RCC)占腎癌病例的90%以上，是全世界最致命的泌尿系統惡性腫瘤之一〔1〕。盡管近年來腎細胞癌的治療取得了進展，但由于腎癌轉移和耐藥性，腎細胞癌患者的總體生存率仍然不令人滿意〔2〕。順鉑(CDDP)是一種鉑類抗癌藥物，已廣泛用于各種癌癥類型，包括RCC〔3〕；然而，其嚴重的副作用和產生的耐藥性往往限制了其在RCC中的臨床應用。據報道，微小RNA(miRNAs)細胞的凋亡、增殖、分化、代謝等多種過程中發揮著關鍵作用〔4，5〕。眾所周知，miRNAs可以通過不完全結合靶基因mRNA的3′-非翻譯區(UTR)來調節基因表達，從而導致翻譯抑制和(或)靶基因降解〔6〕。越來越多的證據表明，miRNAs參與RCC在內的多種腫瘤的發生和發展，并作為腫瘤抑制因子或癌基因發揮作用〔7，8〕。通過miRNAs介導的影響腫瘤化療的耐藥性已成為大量研究的熱點〔9，10〕。

miR-137是一種典型的23-nt miRNA，最初在2002年被鑒定為卵巢癌、乳腺癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、結直腸癌和胃癌中的腫瘤抑制性miRNA〔11～16〕。miR-137在RCC組織中表達下調，并在RCC進展中發揮腫瘤抑制作用〔17〕。此外，一些研究表明，miR-137可能參與調節多種癌癥對多種抗癌藥物的耐藥性〔18～21〕。然而尚不清楚miR-137在RCC細胞化療敏感性中的作用，本研究詳細研究了miR-137對人RCC細胞CDDP敏感性的影響情況。

1 材料和方法

1.1材料 兩種人類RCC細胞系(A498，一種腎癌上皮樣細胞；和786-O，人腎透明細胞腺癌)購自美國ATCC細胞培養庫；胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、LPS 購自 Sigma-Aldrich 公司；TRIzol、Lipofectamine2000試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；miScript RT試劑盒、miScript SYBR Green PCR購自德國 Qiagen公司；雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD 公司；miR-137模擬物和相應的陰性對照miRNA(miR-NC)購自上海基因制藥有限公司；CDDP 購買于Sigma-Aldrich，溶解在0.9%的無菌鹽水中，用于后續實驗；細胞計數試劑盒(CCK)-8購自Dojindo Molecular Technologies，Inc.公司。半胱天冬酶3活性測定試劑盒購自Beyotime Institute of Biotechnology公司，流式細胞儀購自美國 BD 公司，實時熒光PCR儀購自美國 ABI公司；酶標儀和分光光度計購自Sigma-Aldrich公司。

1.2耐藥細胞系的建立 為了建立抗CDDP的RCC細胞(RCC/CDDP)，采用逐漸增加劑量的CDDP處理786-O和A498細胞，直到存活的細胞顯示出正常的生長模式。786-O和A498細胞首先用0.5 μg/ml的CDDP處理4 h，然后釋放到無CDDP的 RPMI1640培養基中，直到恢復。對誘導細胞進行相同的處理，CDDP濃度逐漸增加，最后增加到5 μg/ml。當誘導細胞仍在5 μg/ml的CDDP中存活時，證實細胞對CDDP具有耐藥性，并將這兩種耐CDDP的RCC細胞分別命名為786-O/CDDP和A498/CDDP。

1.3細胞轉染 根據使用說明，使用脂質體2000將miR-137模擬物和對照miR-NC模擬物瞬時轉染到RCC細胞或者RCC/CDDP細胞中(786-O/CDDP和A498/CDDP)。

1.4RNA分離和RT-qPCR 參照TRIzol使用說明，利用TRIzol試劑從培養的RCC細胞和RCC/CDDP細胞中提取總RNA。 miScript RT 試劑盒 用于從1 μg總RNA合成cDNA。使用miScript SYBR Green PCR試劑盒在ABI PRISM 7900熒光定量PCR儀上對miR-137的表達水平進行檢測。反應條件如下：95℃，2 min，95℃，35 s 40個循環，56℃，40 s。引物序列如下：miR-137正向引物為5′-GCGCTTTTGCTTAGATAC-3′，反向5′-CAGTGCAGGGTCAGGT-3′；U6正向引物為5′-GCTTCGGCAGCATATATAT ATATAAAT-3′，反向5′-CGCTTCACGAATTGCGTCAT-3′；miR-137的相對表達量分析使用2-ΔΔCt方法計算〔22〕，以U6 snRNA作為內部對照。

1.5細胞增殖試驗 使用CCK-8測定細胞增殖。將轉染的細胞在96孔板(2×103細胞/孔)中放置24、48、72、96或120 h。隨后，將CCK-8溶液添加到這些孔中在培養2 h。使用分光光度計測量溶液450 nm處的吸光度。

1.6凋亡檢測 轉染后48 h后，使用0.25%胰蛋白酶分離細胞，在細胞內加入異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒。避光15 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。使用CellQuest軟件(版本0.9.3.1)分析凋亡數據。

1.7半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-3活性測定 轉染48 h后收獲RCC細胞。使用Caspase-3活性測定試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology)測定Caspase-3活性。

1.8統計分析 采用SPSS27.0軟件進行t檢驗，Tukey事后檢驗。

2 結 果

2.1RCC抗CDDP細胞株(A498/CDDP和786-O/CDDP)細胞增殖增加 與RCC細胞(A498和786-O)相比，RCC/CDDP細胞(A498/CDDP和786-O/CDDP)48、72、96、120 h的細胞增殖顯著增加(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 CCK8法檢測不同時間點不同細胞株RCC細胞和RCC/CDDP細胞的增殖情況

2.2miR-137在RCC細胞中及RCC抗CDDP細胞中的表達 與正常RCC細胞(786-O：1.0±0.12、A498：1.0±0.14)相比，RCC/CDDP細胞株中miR-137的表達水平顯著降低(0.42±0.06、0.38±0.05，P<0.05,P<0.01)。

2.3轉染 miR-137模擬物增加了miR-137在A498/CDDP和786-O/CDDP細胞中的表達 轉染miR-137模擬物顯著增加miR-137在A498/CDDP和786-O/CDDP細胞中表達(P<0.01)。見表2。

表2 轉染miR-137模擬物或miR-NC的786-O/CDDP和A498/CDDP細胞中miR-137的表達

2.4過表達miR-137降低 A498/CDDP和786-O/CDDP細胞增殖 轉染miR-137模擬物48、72、96、120 h后可顯著降低A498/CDDP和786-O/CDDP細胞的增殖(P<0.05,P<0.01)，見表3。

表3 轉染miR-137對786-O/CDDP和A498/CDDP細胞增殖的影響

2.5過表達miR-137增加 A498/CDDP和786-O/CDDP細胞凋亡 過表達miR-137顯著誘導A498/CDDP和786-O/CDDP細胞凋亡(P<0.05,P<0.01)，見表4。

表4 轉染 miR-137對786-O/CDDP和A498/CDDP細胞凋亡的影響

2.6過表達miR-137增加 A498/CDDP和786-O/CDDP細胞Caspase-3活性 與轉染miR-NC的細胞相比，miR-137過表達顯著增加了A498/CDDP和786-O/CDDP細胞中的Caspase-3活性(P<0.01),見表5。

表5 轉染 miR-137對786-O/CDDP和A498/CDDP細胞中caspase-3表達的影響

3 討 論

先前的研究表明miRNAs通過調節癌基因或抑癌基因來調節RCC化療耐藥性〔9，10〕。如miR-31-5p過表達通過靶向RCC中的mutL同源物1促進索拉非尼耐藥性〔23〕。Sekino等發現，miR-130b通過調節染色體10上刪除的磷酸和張力同源性，增加了RCC細胞對舒尼替尼的耐藥性〔24〕。Li等〔25〕表明，miR-210-3p通過靶向ATP結合盒轉運體亞型C1降低RCC的化療耐藥性。

miR-137已經被報道參與調節幾種癌癥的藥物敏感性〔24〕。例如，miR-137增強了非小細胞肺癌對紫杉醇和CDPP的化療敏感性〔21〕，降低了前列腺癌細胞對比卡魯胺的耐藥性〔18〕，對化療藥物奧沙利鉑的化療敏感性結腸癌細胞〔20〕，并調節了神經母細胞瘤細胞對阿霉素的敏感性〔26〕。然而，miR-137在RCC化療敏感性中的作用尚不清楚。本研究結果表明miR-137可以增強RCC細胞對CDDP的敏感性。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，參與多種因素誘導的細胞凋亡〔27〕。是細胞凋亡發生的最為重要的生化特征，它負責大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性可使細胞凋亡受到抑制，因而Caspase-3活性的改變是反映細胞凋亡的一個重要參數。本研究結果表明對于耐藥的腎癌細胞，CDDP不能通過有效提高Caspase-3的活性而誘導細胞凋亡，而過表達miR-137之后，Caspase-3活性明顯提高，證實miR-137可通過提高Caspase-3的活性而促進凋亡，從而提高CDDP誘導細胞凋亡的能力。