miR-206靶向CXCR4對食管癌細胞增殖和遷移的影響

何松林 肖宗位 丁偉浩 高珂 山地普 毛龍 王文憑

(1成都市第二人民醫院胸外科，四川 成都 610011；2四川大學華西醫院胸外科)

食管癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內的發病率和死亡率都位居前列，其中我國食管癌每年的新發病例占據世界新發病例的一半以上，死亡率則高居世界榜首〔1〕。多數食管癌患者在發現時就已進展到晚期，總體5年生存率只有20%左右〔2〕，因此，深入闡明食管癌的發病機制對其早期診斷、靶向治療和預后評估具有重要意義。微小RNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種長度18～23個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA，成熟的miRNA通過與其靶基因的3′非翻譯區以完全或不完全配對的方式，來降解其靶基因或抑制其轉錄后翻譯，在細胞的發育、增殖、分化及凋亡中發揮著重要的調節作用〔3,4〕。miR-206位于人類第6號染色體，研究顯示，miR-206可與信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT)3、肝細胞生長因子受體(MET)、肌動蛋白相關蛋白復合物(ARPC)3、血管內皮生長因子(VEGF)等多種細胞周期、分裂和凋亡調節相關基因結合，與肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤的侵襲和轉移密切相關〔5,6〕。本研究旨在探究miR-206對食管癌細胞增殖和遷移的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1細胞培養 人正常食管上皮細胞HEEC和人食管癌細胞株EC9706、TE-1、ECA109(美國ATCC細胞庫)采用RPMI1640完全培養基(美國Gibco，含10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素)培養于37℃、5%CO2的細胞培養箱中。細胞培養至密度超過90%后用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2RT-PCR檢測miR-206表達 收集對數期HEEC、EC9706、TE-1和ECA109細胞1×106個，采用RNA小量提取試劑盒和逆轉錄試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取細胞總RNA并逆轉錄為cDNA。根據miR-206和內參U6的核苷酸序列設計RT-PCR引物： miR-206-正義鏈：5′-GCTTCCCGAGGCCACATGC-3′，miR-206反義鏈：5′-CACTTGCCGAAACCACAC-3′；U6正義鏈：5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-反義鏈：5′-TATGGAACGCTTCACGAA-3′。根據RT-PCR試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)說明書配制反應體系，在熒光定量PCR儀上設置反應程序為：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。反應結束后采用2-ΔΔCt法分析miR-206的mRNA相對表達水平。

1.3miR-206過表達細胞系構建 對數期293T細胞胰酶消化后接種到6孔板，培養細胞密度至70%，分別將plent-GFP-NC慢病毒載體和plent-GFP-miR-206慢病毒過表達載體(山東維真生物科技有限公司)與包裝質粒共轉293T細胞，6 h后更換新鮮培養基。48 h和72 h后分別收集細胞培養上清并混合，0.22 μmol/L濾器過濾，測量病毒滴度。人食管癌細胞EC9706培養至對數生長期，胰酶消化后接種到6孔板，培養至細胞密度為70%。將收集的GFP-NC和GFP-miR-206慢病毒上清分別加入到EC9706細胞中。感染48 h后加入濃度為1 μg/ml的嘌呤霉素，持續篩選7 d直至熒光顯微鏡下所有細胞均表達綠色熒光。RT-PCR驗證細胞miR-206表達水平以確認過表達細胞系構建成功，分別命名為GFP-NC組和GFP-miR-206組細胞。

1.4雙熒光素酶報告基因實驗 將野生型趨化因子受體(CXCR)4(CXCR4-WT)和缺失miR-206結合區域的突變體CXCR4(CXCR4-Mut)基因采用分子克隆方法分別構建到熒光素酶報告載體(山東維真生物科技有限公司)上。對數期的GFP-NC和GFP-miR-206細胞胰酶消化后接種到6孔板，培養至細胞密度70%時，分別轉染CXCR4-WT和CXCR4-Mut熒光素酶報告載體。轉染48 h后收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)檢測各組細胞的相對熒光素酶活性。

1.5CCK-8細胞增殖檢測 將野生型CXCR4采用分子克隆方法構建到pcDNA3真核表達載體，將pcDNA3-CXCR4過表達載體轉染GFP-miR-206細胞系，即為GFP-miR-206/CXCR4-OE組。轉染24 h后，胰酶消化GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細胞，并調整細胞密度至2×105個/ml。分別取100 μl GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細胞懸液接種到96孔板，并于接種后第24、48和72小時向各組細胞加入10 μl CCK-8溶液(碧云天生物技術公司)，繼續孵育4 h。酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.6Transwell細胞遷移檢測 對數期GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細胞胰酶消化，并重懸細胞密度至5×105個/ml，分別取100 μl細胞懸液接種到預鋪基質膠的transwell上室(美國Corning公司)，下室加入500 μl完全培養基，繼續培養24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次5 min。甲醇固定20 min后，棉簽輕輕擦拭上室未遷移的細胞，1%結晶紫染色5 min，PBS洗滌3次。室溫干燥后顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞遷移情況。

1.7Western印跡 收集GFP-NC、GFP-miR-206 和GFP-miR-206/CXCR4-OE組對數期細胞各1×106個，PBS洗1次，加入200 μl 細胞裂解液，4℃冰上裂解30 min。14 000 r/min離心15 min，取上清加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液，沸水浴煮沸10 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加入封閉液稀釋的CXCR4抗體(1∶1 000，英國Abcam)、EGFR抗體(1∶2 000，英國Abcam)和VEGF(1∶2 000，英國Abcam)，4℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000，碧云天生物技術公司)，室溫孵育2 h，PBST洗3次，蛋白凝膠成像儀顯影。采用Quantity One凝膠分析軟件分析蛋白相對表達水平。

1.8統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1miR-206表達水平比較 HEEC、EC9706、TE-1和ECA109細胞中miR-206的mRNA相對表達水平分別為1.72±0.13、0.36±0.04、0.51±0.06和0.40±0.04，與HEEC細胞比較，EC9706、TE-1和ECA109細胞中miR-206的mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。

2.2miR-206和CXCR4靶向關系驗證 生物信息學分析顯示miR-206可與CXCR4的3′-UTR區靶向結合，提示CXCR4可能是miR-206的下游靶向基因。熒光素酶報告基因實驗結果表明，與GFP-NC細胞(1.85±0.15)比較，轉染CXCR4-WT的GFP-miR-206細胞相對熒光素酶活性(0.31±0.04)下降，差異有統計學意義(P<0.05)；轉染CXCR4-Mut的GFP-NC細胞(1.77±0.14)和GFP-miR-206細胞相對熒光素酶活性(1.72±0.16)則無顯著差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 生物信息學分析miR-206和CXCR4的靶向關系

2.3miR-206表達對食管癌細胞增殖的影響 與GFP-NC組比較，GFP-miR-206組24 h、48 h和72 h的增殖活力顯著下降(P<0.05)；與GFP-miR-206組比較，GFP-miR-206/CXCR4-OE組24 h、48 h和72 h的增殖活力明顯回升(P<0.05)，見表1。

表1 miR-206表達對細胞增殖活力的影響

2.4miR-206表達對食管癌癌細胞遷移的影響 與GFP-NC組〔(94.04±7.75)個〕比較，GFP-miR-206組遷移細胞數〔(35.11±93.28)個〕顯著下降(P<0.05)；與GFP-miR-206組比較，GFP-miR-206/CXCR4-OE組的遷移細胞數〔(74.88±6.84)個〕明顯回升(P<0.05)，見圖2。

圖2 miR-206表達對細胞遷移的影響(結晶紫染色，×400)

2.5miR-206對表皮生長因子受體(EGFR)、VEGF表達的影響 CXCR4在GFP-NC、GFP-miR-206和GFP-miR-206/CXCR4-OE組細胞中的相對表達水平分別為1.36±0.10、0.45±0.06和1.52±0.14；EGFR的相對表達水平分別為1.52±0.12、0.47±0.05和1.08±0.09；VEGF的相對表達水平分別為1.47±0.12、0.30±0.04和1.11±0.11。與GFP-NC組細胞比較，GFP-miR-206組細胞EGFR和VEGF的蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與GFP-miR-206組細胞比較，GFP-miR-206/CXCR4-OE組細胞EGFR和VEGF的蛋白表達顯著上升(P<0.05)，見圖3。

1～3:GFP-NC組，GFP-miR-206組，GFP-miR-206/CXCR4-OE組

3 討 論

miR-206廣泛存在于機體多種組織、器官和細胞中，在正常生理狀態下呈高表達，而在大部分腫瘤組織中呈低表達，并與腫瘤的增殖、侵襲、轉移及血管生成的發生密切相關〔7〕。但miR-206在食管癌細胞中的表達和作用機制尚不清楚。本研究結果表明miR-206的異常表達在食管癌細胞的發生發展中起著重要作用。

CXCR4作為一種高度保守的七次跨膜G蛋白耦聯受體(GPCRs)，可通過與其配體基質細胞衍生因子(SDF-1/CXCL12a)等的結合，激活下游絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外信號調節激酶(ERK)1/2、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等多條信號通路，在細胞骨架重排、肌動蛋白調動、細胞間信息傳遞、炎癥細胞遷移、黏附及腫瘤轉移中發揮著重要的生理病理功能〔8，9〕。研究顯示，CXCR4在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤等數十種癌癥中高表達，在腫瘤的生長、器官特異性轉移及腫瘤免疫抑制中發揮關鍵作用〔10，11〕。此外，CXCR4在食管癌組織中高表達，并與腫瘤組織浸潤程度、淋巴結轉移及預后密切相關〔12〕。生物信息學和雙熒光素酶報告實驗顯示CXCR4是miR-206的下游靶向基因，表明miR-206可能通過調控CXCR4表達進而改變食管癌細胞生物行為學。

細胞增殖和細胞遷移實驗進一步證明，與對照食管癌細胞比較，miR-206過表達后，細胞的增殖和遷移能力下降，而在miR-206過表達細胞中重新過表達CXCR4后，細胞的增殖和遷移能力又出現明顯的回升，表明miR-206可通過反向下調CXCR4的表達促進食管癌細胞的增殖和遷移。

研究表明VEGF是一種在惡性腫瘤中高表達的血管內皮生長因子，在腫瘤細胞的侵襲、遷移、黏附及血管形成等發明起著關鍵的調節作用，而VEGF的上述調節功能與CXCR4的表達密切相關〔13〕。Liang等〔14〕的研究證明SDF-1/CXCR4通過促進Akt的磷酸化，促進腫瘤細胞中VEGF的表達。EGFR作為細胞膜表面的表皮生長因子受體，可與表皮生長因子(EGF)結合激活下游一系列信號轉導通路，調控細胞的增殖、生長和凋亡，并與腫瘤的形成和發展密切相關〔15〕。研究顯示，Porcile等〔16〕的研究顯示CXCR4可通過刺激EGFR的磷酸化，激活ERK1/2和Akt等細胞內信號通路，進而參與卵巢癌的浸潤和轉移。本研究結果表明miR-206可通過CXCR4調控EGFR和VEGF的表達，并在食管癌細胞的增殖和遷移中發揮重要作用。

綜上所述，miR-206可通過靶向CXCR4抑下調EGFR和VEGF的表達和活化，抑制食管癌細胞的增殖和遷移，有望為食管癌的臨床診療和預后評估開辟新的思路。