LncRNA FAS-AS1對膠質瘤細胞Fas介導凋亡的影響

劉晨 張祥 姚俊朝 榮金奎 劉紅軍 金治賓 王壘壘

(1滄州市中心醫院神經外五科，河北 滄州 061000；2滄州市獻縣人民醫院神經外科；3鹽山阜德醫院急診科)

膠質瘤是原發性顱內中樞神經系統惡性腫瘤之一，占顱內原發惡性腫瘤的50%～60%，具有高侵襲性及高致死性〔1,2〕。目前膠質瘤的治療手段有手術、放療、化療，但由于其浸潤性生長方式及對放化療的耐受性，即便通過手術切除聯合放化療，其整體治療效果依舊欠佳，患者的中位生存期僅有10～14個月，5年生存率僅有5%〔3,4〕。因此，尋找新的可靠的治療靶點成為膠質瘤研究的重點之一。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類非編碼RNA分子，長度超過200個核苷酸，通過參與基因的表達調控，在腫瘤進展中發揮致癌或抑癌作用〔5〕。研究表明，LncRNAs在膠質瘤進展過程中起重要作用，LncRNAs MALAT1高表達與膠質瘤惡性程度、患者預后不良密切相關，LncRNA PLAC2可通過靶向神經膠質瘤中核糖體蛋白L36誘導細胞周期停滯〔6,7〕。LncRNA FAS-AS1可通過介導宿主基因Fas表達影響乳腺癌增殖能力〔8〕。然而，LncRNA FAS-AS1對膠質瘤的影響尚不清楚。本研究旨在探討LncRNA FAS-AS1對膠質瘤細胞Fas介導凋亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器 人腦膠質瘤細胞U251(貨號：YS-1302X)購自美國sciencell公司；胎牛血清(貨號：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM培養基(貨號：KL-P0032)購自德國merck/sigma公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(貨號：11668030)購自美國Life Technologies公司；siRNA-NC、siRNA-FAS-AS1及FAS-AS1、Fas、GAPDH引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；pcDNA3.1(貨號：PVT1004)購自武漢維克賽思科技有限公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；CCK-8試劑(貨號：CK-04)購自日本同仁化學研究所；膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：S0185)購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；Fas抗體、Fas配體(FasL)抗體、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、GAPDH抗體(貨號：ab82419、ab15285、ab196495、ab104156、ab181602)購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國Santa公司；恒溫培養箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司；酶標儀(型號：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；流式細胞儀(型號：BD FACSCanto II)購自美國BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養與分組 U251細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2、90%相對濕度培養箱中培養，細胞融合率達80%以上時，用胰酶消化、傳代。取對數生長期U251細胞分為對照組、si-NC組、si-FAS-AS1組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-FAS-AS1組，對照組不進行轉染，si-NC組、si-FAS-AS1組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-FAS-AS1組細胞使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染siRNA-NC、siRNA-FAS-AS1、pcDNA3.1和pcDNA3.1-FAS-AS1。

1.2.2qRT-PCR法檢測各組U251細胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達情況 將U251細胞轉染后培養48 h，收集細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書，在熒光定量PCR儀上檢測FAS-AS1、Fas mRNA表達水平，以2-ΔΔCt法表示，內參基因為GAPDH。反應程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環40次。FAS-AS1上游引物：5′-ACCGTGAAGGCATAAAAGCAA-3′，下游：5′-TTTTGCGCTCACGACATGC-3′；Fas上游引物：5′-CCCGGACCCAGAATACCAAG-3′，下游：5′-AAGACAAAGCCACCCCAAGT-3′；內參GAPDH上游引物：5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游：5′-TCTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.2.3CCK-8法檢測各組U251細胞增殖情況 將U251細胞轉染后培養48 h，加入CCK-8試劑后繼續培養2 h，使用全自動酶標儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度(OD)值。

1.2.4流式細胞儀檢測各組U251細胞凋亡情況 將U251細胞轉染后培養48 h，收集細胞，胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，使用400 μl 1×結合緩沖液調整成細胞濃度為1×106個/ml的細胞懸浮液，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作說明書步驟，分別加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，避光孵育1 h，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5Western印跡法檢測各組U251細胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達情況 將U251細胞轉染后培養48 h，收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，加入Fas抗體(1∶500)、FasL抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、Bax抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，化學發光法顯色，拍攝圖像，分析條帶灰度，計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度/內參GAPDH條帶灰度。

1.3統計學分析 采用SPSS24.0統計學軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組U251細胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達情況 對照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細胞中FAS-AS1、Fas mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組U251細胞增殖情況 對照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細胞OD值差異無統計學意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細胞OD值顯著升高(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細胞OD值顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組U251細胞凋亡情況 對照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組U251細胞OD值、凋亡率、FAS-AS1、Fas mRNA及Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

圖1 流式細胞儀檢測各組U251細胞凋亡情況

2.4各組U251細胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達情況 對照組、si-NC組、pcDNA3.1-NC組U251細胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與si-NC組相比，si-FAS-AS1組U251細胞中Fas、FasL、Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-FAS-AS1組U251細胞中Fas、FasL、Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

1～5：對照組、si-NC組、si-FAS-AS1組、pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1-FAS-AS1組

3 討 論

膠質瘤是最常見的來源于神經上皮組織的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，發病率、復發率、死亡率高，治愈率低。手術切除聯合放化療是膠質瘤治療的主要方法，但存在一定局限性，高級別的膠質瘤患者易在術后復發，平均生存期低于15個月〔9〕。LncRNA可通過影響RNA的轉錄、剪切、降解等生物學過程，調節多種生物學機制，進而影響細胞的生物學活動〔10〕。研究發現，LncRNA的異常表達在各種癌癥的發生發展中起重要作用，且一些LncRNA可作為膠質瘤的潛在腫瘤標志物或治療靶點〔11,12〕。

FAS-AS1是Fas的反義LncRNA，以反義的方式從人類染色體上的Fas基因中轉錄出來，通過影響RNA剪接調控Fas，與細胞凋亡過程密切相關〔13〕。研究表明，FAS-AS1可通過Fas介導的細胞死亡信號途徑在紅細胞生成過程中起重要作用〔14〕。Zhu等〔15〕研究發現，降低FAS-AS1的表達可抑制軟骨細胞凋亡并促進軟骨細胞增殖。Yang等〔16〕研究表明，FAS-AS1在非小細胞肺癌中顯著下調，能抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程。本研究結果顯示，成功下調U251細胞中FAS-AS1表達水平后，U251細胞OD值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；反之，U251細胞OD值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示FAS-AS1可促進U251細胞凋亡并抑制其增殖，但其相關機制尚不清楚。

Fas是啟動細胞凋亡信號的經典受體之一，與其配體FasL結合后可形成死亡誘導復合物活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8及Caspase家族其他成員，在腫瘤細胞增殖、降解、凋亡過程中發揮重要作用〔17〕。王曉麗等〔18〕研究發現，Fas/FasL通路活化可導致下游Caspase途徑的活化，介導17-羥-巖大戟內酯B誘導的腦膠質瘤細胞凋亡過程。本研究結果顯示，FAS-AS1作為Fas的反義轉錄本，成功下調U251細胞中FAS-AS1表達水平后，U251細胞中Fas mRNA及蛋白表達水平顯著降低，FasL蛋白表達水平亦顯著降低；反之，U251細胞中Fas mRNA及蛋白表達水平顯著升高，FasL蛋白表達水平亦顯著升高，提示FAS-AS1可影響Fas/FasL通路活化。Bcl-2家族蛋白在調控細胞凋亡過程中發揮關鍵作用，其中，抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax是該家族重要成員〔19〕。本研究結果顯示，成功下調U251細胞中FAS-AS1表達水平后，U251細胞中Bax蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高；反之，U251細胞中Bax蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，提示FAS-AS1通過影響Bax、Bcl-2蛋白水平，調控U251細胞增殖、凋亡過程，推測FAS-AS1通過激活Fas/FasL通路，可能經由Caspase家族途徑，影響凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2水平，進而發揮對U251細胞的凋亡促進、增殖抑制作用〔20〕。

綜上所述，LncRNA FAS-AS1可以激活Fas/FasL通路，上調Bax蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達，促進膠質瘤U251細胞凋亡并抑制其增殖，可作為膠質瘤的潛在治療靶點。