電針通過SIRT1-FOXO1通路激活自噬減輕神經病理性疼痛的機制

王磊 沈玉杰 涂韶恒 肖李秋 賀達

(武漢市普仁醫院疼痛科,湖北 武漢 430000)

神經病理性疼痛(NP)屬于損傷或疾病作用于軀體感覺系統引起的一種疼痛，其中脊髓背部自噬受損作為加重NP的主要原因之一，會加重NP〔1〕。NP病理生理過程機制復雜，目前尚缺乏有效的治療方法〔2〕。各種藥物治療尚存在一定的不良反應，電針治療NP安全、簡便且無不良反應，臨床上已證實可有效緩解疾病，但具體作用機制尚需進一步研究〔3，4〕。電針可以調節細胞自噬，具有明顯的鎮痛作用，可以修復損傷神經根從而緩解神經根型頸椎病〔5〕，在NP中電針是否發揮類似作用尚無相關研究。沉默信息調節因子(SIRT)1-叉頭狀轉錄因子(FOX)O1通路調控細胞的自噬活動，進而影響細胞功能，推測電針可能通過SIRT1-FOXO1通路在NP中影響自噬。本研究通過坐骨神經慢性壓迫損傷(CCI)建立NP模型，電針處理后添加SIRT1抑制劑，初步探討電針保護NP的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 48只健康雄性SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)-2018-0004，SPF級，體重(210±10)g。所有大鼠在溫度(24±1)℃、濕度(55±5)%、自然光照條件下自由飲水攝食，定期通風，并更換墊料，在本研究中心暫養7 d進行實驗。本研究經醫院倫理委員會審核并批準。

1.2試劑與儀器 4-0鉻制羊腸線(上海浦東金環醫療用品股份有限公司)；SIRT1抑制劑(selisistat，EX-527，上海陶素生化科技有限公司，貨號：T6111)；山羊抗兔IgG H&L異硫氰酸熒光素(FITC)、一抗SIRT1、微管相關蛋白1輕鏈(LC)3、FOXO1(英國abcam公司，貨號分別為：ab6717、ab189494、ab192890、ab52857)；電子Von Frey刺激針(英國Bioseb公司，型號：EVF3)；熱痛敏刺激儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號：7280)；多功能電針治療儀(蘇州華倫醫療用品有限公司，型號：SH-1)；透射電鏡(賽默飛世爾，型號：Glacios Cryo-TEM)；蛋白凝膠成像系統(美國Bio-rad公司，型號：GelDoc EZ)。

1.3動物分組及處理 實驗分為假手術組、模型組、電針組、電針+抑制劑組，每組12只。除假手術組外，其余各組參考文獻〔6〕建立CCI所致NP大鼠模型，大鼠麻醉后切開右肢皮膚，分離肌肉，暴露出坐骨神經，在坐骨神經中段用4-0鉻制羊腸線扎4圈。大鼠出現跛行、足輕微外翻狀，有時出現舔舐、懸空等現象，表明模型建立成功。假手術組不對坐骨神經線扎，其余步驟與模型相同，實驗每天注射青霉素防止感染。

造模成功第7天參考《實驗針灸學》〔7〕大鼠穴位圖譜，電針組多功能電針治療儀選用“環跳”“陽陵泉”穴電針，給予疏密波2 Hz/100 Hz交替，強度≤1 mA，時間30 min〔8〕；電針+抑制劑組在電針組基礎上分別在第7天、第10天、第14天脊髓鞘內注射SIRT1抑制劑EX-527〔溶于8%二甲基亞砜(DMSO)，2 mg/kg注射〕各1次。假手術組和模型組鞘內注射等體積DMSO。

1.4機械縮足反射閾值(MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(PWTL)測定 造模前、造模后給藥前、給藥后測定MWT和PWTL來評價大鼠機械性觸發痛和熱痛覺過敏。Von Frey纖維絲以up-down法〔9〕推算50%機械縮足閾值：所有大鼠置于有機透明玻璃箱中限制其活動，玻璃箱長20 cm、寬12 cm、高20 cm，箱底放0.5 cm×0.5 cm網格鐵絲網。電子Von Frey刺激針刺激大鼠右足底，從1.0 g開始，逐漸增加纖毛折力，每次間隔30 s，最大力度為15 g，大于此值記為15 g，反射的最小刺激強度即為MWT。每次實驗平行3次，平均值即為MWT。MWT結束后適應1 h，參考Hargeeaves法〔10〕熱痛敏刺激儀照射大鼠右足底，大鼠出現快速抬足或添足行為時停止實驗，記錄輻射照射的持續時間，自動間隔時間30 s，避免灼傷足部，每次實驗平行3次，平均值即為PWTL。

1.5免疫熒光檢測脊髓SIRT1蛋白表達 行為學實驗結束后，每組隨機取6只大鼠，麻醉后于左心室-主動脈插入灌注針，200～250 ml生理鹽水快速沖洗血液，至心、肝、肺變白后，更換為4℃、4%多聚甲醛250 ml灌注，整個灌注過程持續1 h。4%多聚甲醛固定后，暴露脊髓，找到第4、5、6腰椎，并在錐孔處找到腰椎神經節，取出第4～5脊髓節段，置于4℃、4%多聚甲醛固定6 h后轉入30%蔗糖溶液中脫水48 h至組織沉底。組織切片(厚度25 μm、3 μm兩種規格)。25 μm切片經0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，加入羊血清封閉液封閉2 h，更換為一抗SIRT1，4℃封閉48 h，PBS漂洗；添加FITC標記的二抗，37℃封閉2 h，PBS漂洗，避光貼片，37℃烘干后甘油封片，共聚焦顯微鏡攝片。

1.6透射電鏡下觀察脊髓超微結構 3 μm切片用飽和醋酸鈾-醋酸鉛雙重染色，自然條件下干燥，透射電鏡下觀察脊髓超微結構，每張切片10個視野，觀察自噬小體形態及數量變化。

1.7Western印跡檢測脊髓中LC3、SIRT1、FOXO1蛋白水平 行為學實驗結束后，每組剩余6只大鼠麻醉后分離出脊髓，取出第4～5脊髓節段，取部分加入RIPA裂解液后超聲勻漿1 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，上清液為總蛋白，BCA法測定總蛋白，凝膠電泳上樣總蛋白量20 μg分離蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別添加一抗(SIRT1、FOXO1、LC3、GAPDH)，4℃孵育過夜；添加對應二抗，室溫封閉2 h，ECL顯影，蛋白凝膠系統定量分析。

1.8統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1電針對大鼠行為學的影響 造模前，各組MWT、PWTL差異無統計學意義(P>0.05)。造模后給藥前，與假手術組相比，模型組、電針組、電針+抑制劑組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)。給藥后，與假手術組相比，模型組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組MWT、PWTL明顯升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組MWT、PWTL比較

2.2免疫熒光檢測電針對脊髓SIRT1蛋白表達的影響 與假手術組(1.01±0.11)相比，模型組SIRT1蛋白免疫熒光強度(0.53±0.06)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組SIRT1蛋白免疫熒光強度(0.89±0.11)明顯升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組SIRT1蛋白免疫熒光強度(0.39±0.05)明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫熒光檢測各組脊髓SIRT1蛋白表達(×200)

2.3電針對脊髓超微結構的影響 假手術組可見完整的細胞膜或線粒體，自噬小體雙膜結構完整；模型組出現線粒體腫脹破裂現象，且與溶酶體融合，未發現明顯的自噬小體；電針組線粒體結構基本恢復，自噬小體數量多，雙膜包裹里可見少量的內質網碎片；電針+抑制劑組自噬小體數量較電針組明顯減少，自噬小體部分出現單膜結構。見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組脊髓超微結構(飽和醋酸鈾鄄醋酸鉛雙重染色，×10 000)

2.4電針對脊髓中LC3蛋白水平的影響 與假手術組相比，模型組脊髓中LC3Ⅰ蛋白水平明顯升高，LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組LC3Ⅰ蛋白水平明顯降低，LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組LC3Ⅰ蛋白水平明顯升高，LC3Ⅱ蛋白水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低(P<0.05)。見表2、圖3。

1～4：假手術組、模型組、電針組、電針+抑制劑組；圖4同

2.5電針對脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平的影響 與假手術組相比，模型組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)；與電針組相比，電針+抑制劑組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平降低(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組脊髓中LC3、SIRT1、FOXO1蛋白水平比較

圖4 Western印跡檢測各組脊髓中SIRT1、FOXO1蛋白水平

3 討 論

NP涉及多種細胞、分子和通路過程，而自噬廣泛參與生理病理過程，對于維持細胞穩態具有重要作用，且近年來自噬與NP的發生發展成為一個新的研究熱點〔11〕。自噬對于神經元的動態平衡至關重要，可以對環境變化做出反應從而免受環境改變和病理刺激，在NP中促進自噬可促使蛋白質和細胞器穩態轉換，對于維持突觸完整性和可塑性等具有至關重要的作用〔12〕。NP中醫屬痹癥范疇，環跳、陽陵泉穴位深層解剖為坐骨神經及其分支，電針刺激穴位臨近神經及其周圍血管，可以促進血液循環，改善局部癥狀〔13〕，但其作用機制尚需進一步研究。本研究結果提示NP大鼠對刺痛、熱痛的敏感性降低，可能是NP本身疼痛降低對外界的反應；脊髓自噬小體數量少，機體神經修復作用降低，不能維持細胞穩態。而電針提高對痛的敏感性，并可增加自噬小體數量，從而促使蛋白質和細胞器穩態轉化等，進而維持環境的動態平衡，對于NP具有保護作用，但機制尚需進一步研究。

SIRT1屬煙酰腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙酰化酶，在各組織中廣泛存在，作用機制研究較清晰，屬FOXO1轉錄調控主要調節因子；而FOXO1與自噬關系密切，激活SIRT1可以活化FOXO1從而調節自噬〔14〕。FOXO1屬轉錄因子的叉頭家族，具有保守的DNA結合結構域，SIRT1可以增強FOXO1的DNA親和力〔15〕。本研究結果提示，NP中SIRT1-FOXO1通路受到抑制，機體處于自噬抑制狀態。細胞中正常情況下LC3加工成胞質可溶性LC3Ⅰ；當機體發生自噬時，LC3Ⅰ經過泛素化樣加工和修飾，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結合成LC3Ⅱ，特異性表達于自噬小體膜上，是自噬小體的分子標志，對于自噬的檢測具有重要意義〔16，17〕。本研究結果提示NP中自噬的標志性蛋白合成處于抑制狀態，此時自噬狀態較弱。而電針刺激后可升高LC3Ⅱ水平，促進自噬小體的生成。同時發現，SIRT1可以促進FOXO1和FOXO3a的活性，增強DNA親和力，入核與Atg8、Atg12的啟動子序列結合，促進LC3的去乙酰化，促進LC3的核質轉移和自噬體的形成過程〔18～20〕，推測SIRT1可能促進FOXO1的表達從而促進LC3Ⅱ蛋白形成，促進自噬體的形成。本研究結果提示，電針通過激活SIRT1-FOXO1通路促進LC3Ⅱ蛋白形成，進而促進自噬小體形成。在電針的基礎上添加SIRT1抑制劑，脊髓中SIRT1-FOXO1通路受到抑制，LC3Ⅱ蛋白水平降低，刺痛、熱痛的敏感性又降低，進一步提示電針可能通過激活SIRT1-FOXO1通路進而促進自噬形成，從而實現對NP的保護。