順阿曲庫銨通過調控miR-3666表達抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲

周霞 劉德智 孟瑞霞 王培山

(新鄉市中心醫院 1麻醉與圍術期醫學科，河南 新鄉 453000；2 RICU)

膀胱癌(BCa)是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，手術是其主要治療方式，但其具有極高的復發率，導致患者預后不良〔1,2〕。相關研究〔3〕指出麻醉方式和麻醉藥物會影響腫瘤患者術后的轉移與復發。闡述麻醉藥物、技術對術后腫瘤轉移及復發的影響，可為臨床麻醉策略提供參考〔4〕。順阿曲庫銨是阿曲庫胺的同分異構體之一，一種新型強效中時效非去極化型肌松藥，可安全用于臨床麻醉〔5〕。研究報道順阿曲庫銨通過改變p53依賴的凋亡途徑，在體外有效抑制結直腸癌HCT116細胞的增殖并誘導其凋亡〔6〕。順阿曲庫銨可抑制食管鱗狀細胞癌細胞上皮間質轉化(EMT)，抑制細胞的侵襲、遷移及增殖，并促進其凋亡〔7〕。然而順阿曲庫銨對膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響及機制還尚未清楚。研究表明，miRNA可以作為癌基因或抑癌基因在膀胱癌中發揮作用〔8〕。miR-3666在胃癌患者中低表達，參與胃癌的淋巴結轉移，會引起胃癌患者預后不良〔9〕。circ_0018069通過攜帶包括miR-3666在內的多種miRNA形成黏著信號通路，在膀胱癌中發揮抗癌作用〔10〕。miR-3666通過靶向溴區PHD結構域轉錄因子(BPTF)抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲性〔11〕。miR-3666通過靶向特殊富含AT序列結合蛋白(SATB)2抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲〔12〕。而miR-3666對膀胱癌細胞及順阿曲庫銨是否通過調控miR-3666影響膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲目前未知。本實驗旨在研究順阿曲庫銨可能通過調控miR-3666對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、RPMI1640培養基購自武漢益普生物；膀胱癌細胞株T24購自上海北諾生物；MTT試劑盒由上海谷研生產；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒由深圳子科生物生產；苯磺順阿曲庫銨由江蘇恒瑞醫藥生產；Transwell小室、基質膠由美國BD公司生產；RT-qPCR試劑盒由北京麥瑞博生物生產。

1.2細胞處理與分組方法 將膀胱癌細胞T24培養在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，取對數期細胞。用順阿曲庫銨分組，分別采用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 順阿曲庫銨處理，分為順阿曲庫銨低(Cis-L組)、中(Cis-M組)及高濃度(Cis-H組)組，并將正常培養細胞記作Con組。用miR-NC、miR-3666轉染T24細胞分組，分為miR-NC組和miR-3666組。用anti-miR-NC、anti-miR-3666轉染T24細胞分組，用40 μmol/L 順阿曲庫銨處理，分為Cis+anti-miR-NC組和Cis+anti-miR-3666組。

1.3MTT檢測細胞增殖抑制率 將細胞培養24 h，在每孔中加入20 μl的MTT并孵育4 h，再在每孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，然后用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD)值，最后得出細胞增殖抑制率。

1.4Transwell檢測細胞遷移和侵襲實驗

1.4.1遷移實驗方法 細胞調整密度為5×105個/ml，上室加100 μl懸浮液，下室加600 μl培養液，培養24 h，采用多聚甲醛固定30 min后，使用結晶紫進行30 min染色，然后用倒置顯微鏡拍照和觀察，最后計算細胞遷移數。

1.4.2侵襲實驗方法 T小室的上室加入適量基質膠，按上述方法操作，最后計算細胞侵襲數。

1.5Western印跡檢測蛋白表達方式 首先收集細胞提取總蛋白并定量煮沸變性。其次行電泳，轉膜后用5%脫脂奶粉封閉，加一抗4℃孵育過夜。最后加入二抗室溫孵育2 h，使用電化學發光(ECL)顯影，成像后檢測蛋白條帶的灰度值。

1.6RT-qPCR檢測miR-3666表達 各組細胞培養48 h后提取細胞總RNA，合成cDNA，并以U6為內參行PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。miR-3666上游引物5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游5′-CAGTGCAAGTGTAGATGCCGA-3′；U6上游引物5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游5′-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。

1.7統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1順阿曲庫銨對膀胱癌T24細胞增殖的影響 與Con組比較，Cis-L、M、H組細胞增殖抑制率、p21表達水平顯著升高，細胞周期蛋白(Cyclin)D1表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 各組增殖相關蛋白表達

表1 順阿曲庫銨對膀胱癌T24細胞增殖及CyclinD1、p21蛋白表達的影響

2.2順阿曲庫銨對膀胱癌T24細胞遷移、侵襲的影響 與Con組比較，Ois-L、M、H組細胞遷移、侵襲、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

表2 順阿曲庫銨對膀胱癌T24細胞遷移、侵襲的影響

2.3順阿曲庫銨對膀胱癌T24細胞中miR-3666表達的影響 與Con組(1.00±0.06)比較，Cis-L、M、H組miR-3666表達水平顯著升高(1.64±0.18、2.25±0.24、3.07±0.21；F=203.625，P<0.001)。

2.4過表達miR-3666對膀胱癌T24細胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-3666組miR-3666表達水平、細胞增殖抑制率、p21表達水平均顯著高于miR-NC組，miR-3666組細胞遷移、侵襲細胞數及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達

表3 miR-3666過表達對膀胱癌T24細胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.5抑制miR-3666表達逆轉順阿曲庫銨(40 μmol/L)對膀胱癌T24細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與Cis+anti-miR-NC組比較，Cis+anti-miR-3666組miR-3666表達水平、細胞增殖抑制率、p21表達水平顯著降低，細胞遷移、侵襲細胞數及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高(P<0.05)。見表4，圖4。

表4 抑制miR-3666表達逆轉了順阿曲庫銨對膀胱癌T24細胞增殖、遷移和侵襲的作用

1，2：Cis+anti-miR-NC組，Cis+anti-miR-3666組

3 討 論

膀胱癌是我國泌尿系統惡性腫瘤中發病率最高的腫瘤，且其復發率及死亡率也較高〔13,14〕。研究顯示，順阿曲庫銨抑制結直腸癌細胞增殖和轉移〔15〕。順式阿曲庫胺可抑制肺癌細胞A549和肝癌HepG2細胞增殖和轉移，促進凋亡〔16〕。本實驗用不同濃度順式阿曲庫胺處理膀胱癌細胞T24，結果顯示，順式阿曲庫胺可劑量依賴性的抑制膀胱癌細胞T24增殖、遷移和侵襲。且順式阿曲庫胺降低了CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平，提高了p21表達水平。CyclinD1、p21是細胞周期相關蛋白，其異常表達可影響細胞增殖〔17,18〕。MMP-2、MMP-9通過降低細胞外基質可促進細胞遷移、侵襲〔19〕。本研究結果表明，順式阿曲庫胺抑制膀胱癌細胞T24增殖、遷移和侵襲的作用可能與細胞增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達水平有關。

miRNA是一類小的非編碼RNA， miRNA在調節癌癥發展和轉移有關的基因中具有重要作用〔20〕。已有研究報道miR-3666參與調控多種腫瘤的惡性生物學行為，如宮頸癌組織中miR-3666水平顯著降低，垂體瘤轉化基因(PTTG)1調控miR-3666介導的鋅指結構E-box結合蛋白(ZEB)1可增強宮頸癌細胞侵襲能力〔21〕。miR-3666通過靶向賴氨酸脫甲基酶(KDM)2A抑制膠質母細胞瘤細胞的生長和遷移〔22〕。miR-3666過表達顯著抑制甲狀腺癌細胞的生長〔23〕。miR-3666過表達通過靶向沉默寡糖蛋白(SIRT)7抑制乳腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡〔24〕。miR-3666還可通過靶向SIRT7促進促凋亡信號通路進而抑制非小細胞肺癌細胞生長〔25〕。以上研究表明miR-3666可通過靶向調控其靶基因影響多種腫瘤的進展。而本實驗發現，miR-3666過表達可抑制膀胱癌細胞T24增殖、遷移和侵襲，miR-3666在膀胱癌中的作用與在其他癌癥中作用相似。

本實驗用不同濃度的順式阿曲庫胺處理膀胱癌細胞T24后，miR-3666表達水平呈劑量依賴性升高。將miR-3666抑制劑轉染至T24細胞后用順式阿曲庫胺處理，結果顯示，細胞增殖抑制率降低，細胞遷移、侵襲升高。表明抑制miR-3666表達逆轉了順阿曲庫銨對膀胱癌T24細胞增殖、遷移和侵襲的作用。