中老年白癜風患者皮損組織差異表達基因篩選及生物信息學

張靜 邢衛斌 王琳

(天津市第五中心醫院皮膚科，天津 300450)

白癜風是一種后天性色素脫失性疾病，遺傳背景的基礎上免疫因素發揮了重要作用。全基因組掃描技術發現白癜風患者有超過50個易感基因位點〔1～3〕，并且有家族史的白癜風患者更容易發展為嚴重臨床類型〔4，5〕。中老年患者發病率相對較低，發病機制研究自然較少。本次研究利用基因表達綜合數據庫(GEO)數據庫納入的中老年白癜風患者數據信息，全面分析其皮損組織和自身正常皮膚組織基因表達譜差異，篩選可能的關鍵致病基因，旨在為進一步闡明中老年患者白癜風發病的遺傳學機制提供線索。

1 材料和方法

1.1數據來源 30例樣本均來自15例患者的皮損與自身正常皮膚組織，患者年齡均在40～65歲，病程1個月至3年?；虮磉_譜數據來源于GEO數據庫，基于GPL6884平臺Illumina HumanWG-6 v3.0 expression beadchip芯片。

1.2差異表達基因篩選 根據GPL6884平臺探針的信息注釋相應的基因，利用R(version4.0.1)的scale函數對基因的表達矩陣進行歸一化處理，然后使用limma包分析差異表達基因，BH方法對統計P值進行矯正，選取log2|Fold Change(FC)|>1.5及校正后PBH<0.05 作為差異表達基因的閾值。

1.3功能富集分析 利用toppgene在線工具對差異表達基因進行通路富集分析，PBH<0.05為閾值篩選顯著富集的京都基因與基因組數據庫(KEGG)和反應通路和生物學過程數據庫(Reactome)生物學通路。利用R包cluster Profiler(version3.8.1)對差異表達基因進行GO富集分析，PBH<0.05為閾值篩選顯著富集的生物學過程(BP)、細胞組分(CC)及分子功能(MF)。

1.4基因互作網絡分析 利用STRING數據庫對差異表達基因建立相互作用網絡。

1.5所用到的數據庫 GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；toppgene(https：//toppgene.cchmc.org/)；KEGG(www.genome.jp/kegg)；Reactome(https：//reactome.org)；基因本體論(GO，http：//www.geneontology.org/)；STRING(https：//string-db.org/)。

2 結 果

2.1差異表達基因 白癜風患者皮損組織與自身正常皮膚組織基因表達譜差異統計分析中篩選出了141個顯著差異表達基因，其中122個基因表達上調，19個基因表達下調。位于4號染色體上的趨化因子CXC配體(CXCL)10上調差異表達最為顯著，差異倍數log2FC=2.67，PBH<0.001。位于9號染色體上的酪氨酸相關蛋白(TYRP)1下調差異表達最為顯著，差異倍數log2FC=-2.40，PBH<0.001。由于篩選出的差異基因較少，因此利用R包OmicCircos對log2|FC|>1，P值<0.05的1 011個基因的表達情況進行可視化見圖1。圖內共有5個軌道，從外向內，最外層軌道為染色體坐標，第二層軌道為基因的表達熱圖，第三層軌道為基因表達的PBH散點圖，PBH值越小散點則越大，第四層軌道為基因表達的差異倍數(log2FC)的折線圖，最內層軌道為差異表達基因的互作網絡圖。左側部分對我們篩選出的關鍵基因CXCL10和TYRP1的表達情況進行突出顯示。

圖1 皮損組織與自身正常皮膚組織差異基因表達情況

2.2功能富集分析 利用PBH<0.05作為閾值篩選到了26條顯著富集的GO條目(13條BP條目和13條CC條目，未篩選出顯著的MF條目)。從結果可以看出大部分條目與基因的轉錄、翻譯過程相關。見圖2。不同的散點形狀表示不同的GO類別，圓圈表示BP條目，三角形表示CC條目；散點的大小表示差異表達基因映射到該條目中基因的個數；顏色反映了富集的顯著性，顯著性越高，PBH值越小，顏色越紅；橫軸GeneRatio為映射到該條目的基因個數與該條目中基因總個數的比值。

圖2 差異表達基因顯著富集的GO BP、CC條目

2.3基因相互作用網絡 將141個差異表達基因映射到STRING數據庫的蛋白質互作網絡中得到了

199條互作對(結果如圖1最內層軌道所示)。其中對表達最為顯著的差異基因CXCL10和TYRP1網絡節點圖單獨顯示(黃色標注，見圖3)，可以看出兩個基因通過多巴色素互變異構酶(DCT)和CD69相互聯系，又分別和其他基因存在著錯綜復雜的關系，并且CXCL10相對處于比較核心地位。

TYR：酪氨酸酶；SOX10: 性別決定區盒基因-10；POU3F1: POU結構域第3類轉錄因子1；MLANA： 黑色素A；RGS1: 蛋白信號調節因子1；LEO1：paf1/RNA聚合酶Ⅱ復合物組分；IFIT1: 干擾素誘導的四肽重復蛋白1；IFI27：干擾素-α誘導蛋白27

2.4通路富集分析 利用PBH<0.05作為閾值篩選到了21條顯著富集的生物學通路(18條Reac-tome通路和3條KEGG通路，見表1)，從結果可以看出大部分通路與基因的轉錄和翻譯及氨基酸代謝相關。有部分基因參與了酪氨酸的代謝和黑素生成。

表1 差異表達基因顯著富集的生物學通路

3 討 論

白癜風患者有明顯的家族遺傳背景，有人對150例白癜風患者的家族發病情況進行調查發現，家族陽性史可占到26.0%，其中一級，二級，三級親屬共患率分別為14.6%，16.0%，4.7%，并表明遺傳因素在非節段型的白癜風患者中具有更為明顯傾向〔6，7〕。而自身免疫學說在遺傳背景下發揮了重要的致病作用，文獻研究證實中老年白癜風患者伴有自身免疫性甲狀腺疾病、系統性紅斑狼瘡及類風濕關節炎等疾病的概率遠高于一般人群，可能和細胞凋亡，免疫細胞異常活化及大量抗體的產生有關〔8，9〕。本次研究發現CXCL10基因顯著上調表達，相關文獻也證實了這一點〔10～12〕。CXCL10可由多種細胞分泌，如角質形成細胞，中性粒細胞及樹突細胞。有研究發現黑素細胞本身在炎癥因子刺激下也可分泌CXCL10〔13～15〕。白癜風皮損中存在大量促炎細胞及細胞毒性CD8+T細胞，CD8+T細胞被抗原刺激活化后分泌大量的干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細胞因子，這些細胞因子可誘導多種細胞分泌趨化因子，使T細胞由外周向皮損組織定向遷移。這些抗原可能是皮損中的黑素細胞，研究發現白癜風患者黑素細胞本身的抗氧化能力下降，易受活性氧(ROS)的損傷，細胞內過多的ROS聚集導致黑素細胞內DNA的損傷。同時白癜風患者角質形成細胞也存在氧化應激損傷，p38磷酸化等，不僅不能正常分泌維持黑素細胞生長的一些營養源。同時角質形成細胞的損傷也導致IFN-γ介導CXCL9/10-CXC趨化因子受體(CXCR)3軸異常激活，引起CXCL10在皮損中表達增加，血清亦是如此。CXCL10表達增加將進一步募集更多的CD8+T細胞遷移皮損介導黑素細胞的破壞〔16，19〕。研究發現經過治療后的白癜風患者血清和皮損組織的CXCL10表達水平明顯降低。所以趨化因子CXCL10不僅可以作為本病的一個治療靶點，同時也可以作為療效監測指標指導預后，甚至可以作為一個白癜風診斷的血清學指標，這些都有待后續研究進一步證實。黑素為一組單體吲哚分子通過共價鍵連接，并于醌和蛋白質高度聚合而形成的一種異質性聚合物。在黑素形成過程中，TYR、TYRP1及TYRP2等構成的酪氨酸相關蛋白(TRP)發揮著重要作用，同時這些蛋白也是黑素形成的物質基礎。這些蛋白和基因同時受到小眼畸形相關轉錄因子(MITF)的轉錄調控，它們共同構成立體網絡調控黑素細胞的發育，分化和功能〔20〕。白癜風是典型的黑素缺陷和(或)功能障礙性疾病，國內學者曾對20例尋常型白癜風患者皮損區域黑素細胞培養并進行免疫印跡發現在患者皮損中，TYRP1，TYRP2及MITF均出現一致性的下調表達〔21〕，這一點和本次研究結果是完全吻合的。說明TYRP1的顯著下調，影響了黑素合成的質和量，從而出現了色素脫失性皮損。MITF的表達水平本研究未涉及，有文獻表明在節段型的白癜風患者，兩者表達水平并非一致，這些有待于后續研究進一步證實。

綜上，白癜風是在遺傳基因表達異常情況下引起黑素合成受限，黑素細胞受到破壞的疾病。利用關鍵因子作為靶點制備新的生物制劑有望開辟一個新的治療前景。