老年COPD患者外周血輔助性T細胞17/調節性T細胞失衡對繼發真菌感染的影響

曹振華 王蕾 魏永潔

(青海省人民醫院老年醫學科，青海 西寧 810000)

我國慢性阻塞性肺疾病(COPD)發病率在不同年齡段差異較大，20～40歲人群中約8.6%，40 歲以上人群約13.7%，患者總體數量達1億多〔1〕。COPD發病率和死亡率不斷上升，在全世界死因中排名中已躍升至第四位〔2〕。老年性群體為COPD高發群體，且多數合并心血管基礎疾病，加之近幾年抗菌藥和激素的不合理使用，COPD患者尤其是老年患者感染真菌的病例數顯著增加〔3〕。COPD患者一旦發生真菌感染，病情復雜多變，臨床治療更為棘手，嚴重影響患者預后。近幾年，輔助性T細胞(Th)17、調節性T細胞(Treg)在真菌感染中的作用受到眾多學者關注，有研究顯示〔4〕，Th17型免疫反應及Treg在真菌的清除機制和抑制真菌感染引起的炎癥反應方面發揮重要作用，真菌感染后Th17/Treg比值出現下調。也有多數研究證實〔5,6〕，COPD患者氣道高反應與Th17/Treg比值失衡存在密切關系，在COPD患者中Th17/Treg比值出現上調。由上述研究可知，老年COPD患者Th17/Treg比值已處于高水平，繼發真菌感染后，Th17/Treg變化情況及Th17/Treg細胞失衡對真菌侵襲老年COPD患者的影響尚未有文獻報道。本研究旨在探討老年COPD患者Th17/Treg失衡對繼發真菌感染的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2019年1月至2021年12月青海省人民醫院收治的老年COPD患者117例為研究組，根據病原學檢查結果，并參照《感染性疾病診療指南》中關于真菌感染的診斷標準，將患者分為繼發真菌感染COPD組(n=31)和單純COPD組(n=86)兩個亞組，另選擇同期來醫院體檢健康者90例為對照組。研究組納入標準：①診斷為COPD，參照《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》〔7〕中的診斷標準，均行肺功能檢查，存在不完全可逆的氣流受限〔1 s用力呼氣容積(FEV1)<80%預計值，且FEV1/用力肺活量(FVC)<70%〕；②入院后繼發真菌感染診斷標準：患者出現真菌感染相關臨床表現，以同一檢驗標本中(包括血液、尿液、痰、皮屑等)連續2次在電鏡下檢出真菌孢子和真菌菌絲，或標本進行培養出同一真菌為準，并參照《感染性疾病診療指南》〔8〕中關于真菌感染的診斷標準；③年齡≥65歲。研究組排除標準：①入組前已存在嚴重感染；②合并肺部其他嚴重疾病者，如肺癌、支氣管擴張、肺結核等；③合并其他臟器如心、肝、腦、腎等功能嚴重異常者。對照組納入標準：①常規體檢無明顯異常者，均行肺功能檢查無氣流受限；②年齡≥65歲。對照組排除標準：存在急慢性感染性疾病者。3組基線資料無統計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 3組基線資料比較

1.2檢測方法 Th17、Treg水平測定：采用肝素抗凝管采集受試者空腹外周靜脈血8 ml，送至檢驗科分離出外周血單個核細胞(PBMC)備檢。(1)Th17水平測定。①取樣：取一定密度(1×106)的單個核細胞，加入佛波醇乙酯(劑量5 μg/L)和離子霉素(劑量1 mg/L)置于37℃保溫箱中，經5 h孵育后采用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行2次沖洗；②染色：在避光環境下進行染色處理(溫度控制在4℃)，染色劑為CD3-Percp和CD4-APC，加入數量均為20 μg，染色30 min后再次采用PBS進行2次沖洗；③固定：對沖洗后的標本進行固定，固定液為Fix/Premmedium A，固定時間為15 min；④破膜染色，染色劑為Fix/Prem medium B液和FITC-IL-17A，避光置于室溫下，25 min后采用PBS進行2次沖洗；⑤儀器測定：采用BECKMANCoULTER流式細胞儀(型號：CytoFLEX)檢測Th17水平。(2)Treg水平測定。①取樣：取樣方法同上；②染色：在避光環境下進行染色處理(溫度控制在4℃)，染色劑為CD3-Percp、CD4-APC及CD25-PE，加入數量均為20 μg，染色30 min后再次采用PBS進行2次沖洗；③固定：對沖洗后的標本進行固定，固定液為Foxp3/固定破膜工作液，固定時間為30 min；④離心，固定時間結束后，對標本進行離心處理(800 r/min離心5 min)，去除上清后采用Foxp3破膜緩沖液進行1次沖洗；⑤破膜染色，染色劑為FITC-Foxp3抗體，避光置于4℃環境下，30 min后采用PBS進行2次沖洗，并采用PBS重懸細胞；⑥儀器測定：采用BECKMANCoULTER流式細胞儀(型號：CytoFLEX)檢測Treg水平。(3)根據Th17、Treg測定值計算Th17/Treg比值。比較研究組與對照組及研究組兩個亞組Th17/Treg差異，分析其對老年COPD患者繼發真菌感染的影響。

1.3統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、方差分析、Logistic回歸分析及線性回歸檢驗分析。

2 結 果

2.1兩組外周血Th17、Treg、Th17/Treg水平比較 相比對照組，研究組Th17水平更高，Treg水平更低，Th17/Treg比值顯著上調，差異有統計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 兩組外周血Th17、Treg、Th17/Treg水平比較

2.2繼發真菌感染COPD組與單純COPD組不同臨床病理因素比較 兩組激素使用劑量、激素使用時長、抗菌藥使用時長、血漿白蛋白、住院時長及外周血(Th17、Treg、Th17/Treg)水平差異有統計學意義(P<0.05，P<0.001)，見表3。

表3 繼發真菌感染COPD組與單純COPD組不同臨床病理因素比較

2.3老年COPD患者繼發真菌感染臨床病理因素的 Logistic 回歸分析 Logistic回歸分析(因變量：老年COPD患者是否繼發真菌感染，自變量：各種臨床病理因素)結果顯示，大劑量激素使用、長期激素和抗菌藥使用、長期住院、Th17/Treg比值下調是老年COPD患者繼發真菌感染的高風險因素(P<0.05)，見表4。

表4 老年COPD患者繼發真菌感染臨床病理因素的 Logistic 回歸分析

2.4Th17/Treg水平與老年COPD患者感染真菌的相關強度分析 線性回歸分析顯示，Th17/Treg細胞失衡對真菌侵襲老年COPD患者有重要影響(P<0.001)，得到線性回歸方程:Y=-1.418-0.737X，見表5。

表5 Th17/Treg水平與老年COPD患者感染真菌的相關強度分析

3 討 論

COPD患者主要表現為呼氣過程中氣流明顯受限，且氣流受限不能完全緩解，隨著時間呈進行性發展〔9〕。有國外文獻指出〔10〕，存在肺部基礎疾病患者是繼發肺部侵襲性真菌感染的高風險人群，尤其是COPD患者，繼發肺部真菌感染發生率可高達44%以上。國內COPD患者繼發肺真菌感染發生率目前尚無統一結論，就目前一些樣本資料統計發生率在11%～44%，本研究為26.50%，在上述范圍內。肺部真菌感染會加速病情惡化，增加患者死亡風險，盡早接受足療程、足量抗真菌治療，對降低死亡率至關重要〔11〕。肺部真菌感染的臨床表現、實驗室檢查及影像學檢查無典型特征，臨床較難鑒別。Th17、Treg為近幾年新發現的T細胞亞群，兩者存在促炎和抑制炎癥的相反功能，在感染性疾病、自身免疫性疾病發展過程中扮演重要角色〔12〕。史廣超等〔13〕研究指出，Th17/Treg失調為真菌侵襲機體的重要途徑，由此推測，Th17/Treg失衡可能對真菌侵襲老年COPD患者存在一定影響。

既往劉兆陽〔14〕、戴克芬等〔15〕研究已證實，老年COPD患者已存在Th17/Treg免疫失衡，與肺功能正常健康人群相比，COPD患者Th17/Treg明顯上調。本研究結果表明老年COPD患者整體Th17/Treg比值處于高水平，與上述研究結果一致。

Th17、Treg隸屬于CD4 T淋巴細胞，Th17由激活的CD4+T細胞在白細胞介素(IL)-21與轉化生長因子(TGF)-β或IL-6與TGF-β的相互作用下，經STAT3通路最終分化而來，其主要功能為分泌IL-17、IL-22等炎癥因子，使炎癥反應加劇〔16〕。Treg由胸腺及外周CD4+T細胞分化，主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，是一類具有免疫負性調節的T細胞亞群，其主要功能為誘導和維持機體的免疫耐受，保持機體自身免疫平衡〔17〕。免疫反應在COPD發生發展的重要作用已得到公認，在常態下，Treg與Th17既有相互拮抗作用同時又保持動態平衡，COPD患者氣道長期反復暴露于感染、刺激性煙霧等有害因素下，不斷刺激并活化Th17，Th17產生的炎癥反應超過了Treg的抗炎效應，Th17與Treg的動態平衡被打破，使得炎癥持續進展導致肺損傷和肺氣腫形成〔18〕。本研究結果表明，老年COPD患者繼發真菌感染后，以往高水平Th17/Treg會一定程度下降。張亞武〔19〕研究發現繼發真菌感染老年獲得性免疫缺陷綜合征患者Th17/Treg比值顯著低單純老年獲得性免疫缺陷綜合征患者，與本研究結果相似。當真菌入侵機體后，會刺激機體分化出Th17細胞，并觸發機體Th17型免疫反應。有研究發現〔20〕，在IL-17信號通路中缺失ACT1及IL-17RA、IL-17RC因子的小鼠，發生真菌(假絲酵母菌)感染的機會增加。也有研究通過鼻內途徑使小鼠肺部感染真菌(曲霉菌)，結果發現IL-17和IL-23可發揮抗真菌免疫反應，主要機制為IL-17和IL-23可抑制干擾素(IFN)-γ、IL-12等因子介導的Th1保護性反應，造成Th1細胞失控〔21〕。由此可見，Th17水平的下降削弱了機體抗真菌免疫反應。研究表明〔4〕，真菌侵襲機體后，感染早期Treg通過分泌IL-10及調節細胞毒性T細胞來控制過度的炎癥反應，感染晚期可通過抑制Th2細胞介導的免疫反應來控制炎癥發展，減輕炎癥對機體組織產生的病理損傷。但Treg過度的免疫抑制有可能阻礙Th17對真菌的清除作用。由此可見，Th17/Treg比值的下調為真菌入侵提供了重要契機。實際臨床工作中，醫生可結合患者實際情況，若COPD患者存在長期激素或抗菌藥使用史、住院時間較長等高危因素，同時發現Th17/Treg比值在原基礎上下調，應高度懷疑患者繼發真菌感染，并完善相關檢查予以確診和治療。本研究經線性回歸分析再次證實，Th17/Treg細胞失衡對真菌侵襲老年COPD患者有重要影響。

綜上，Treg與Th17在COPD的發生發展中發揮重要作用，同時Treg/Th17失衡為真菌侵襲老年COPD患者提供重要契機，但其作用機制相關研究較少，有待臨床進一步擴大樣本探究。