桔梗PgHMGS和PgHMGR基因克隆與原核表達分析

余函紋， 劉夢麗， 李 景， 彭華勝， 韓邦興， 查良平, 2*， 桂雙英, 3, 4, 5*

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫科學院中藥資源保護與開發研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫藥科學院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；4.現代藥物制劑安徽省教育廳工程技術研究中心，安徽 合肥 230012；5.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；6.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237010)

桔梗始載于《神農本草經》[1]。桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.的干燥根，有宣肺利咽、祛痰排膿的功效[2]。桔梗作為我國傳統的藥食同源類品種，也是著名的十大皖藥之一，主產于安徽、山東、內蒙古等地區[3]。桔梗中含有多種生物活性成分，包括三萜皂苷、黃酮、酚、多糖等，其中三萜皂苷為桔梗的主要活性成分。桔梗皂苷具有抗炎[4-5]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8-9]、護肝[10-11]等作用。

目前已從桔梗中分離并鑒定的三萜皂苷類成分有70余種，均為齊墩果烷型三萜皂苷，依據桔梗皂苷母核結構變化規律可將桔梗皂苷分為桔梗酸類、桔梗二酸類和遠志酸類3種主要類型[12]。桔梗皂苷生物合成主要包含3個階段。起始階段通過MVA途徑和MEP途徑生成萜類前體物質二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和異戊烯焦磷酸(IPP)[13]。MVA途徑是植物中三萜生物合成的主要前體途徑[14-15]，乙酰輔酶A在乙酰輔酶A酰基轉移酶(AACT)和HMG-CoA合成酶(HMGS)作用下生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)[16]。HMG-CoA又在HMG-CoA還原酶(HMGR)催化下生成MVA，MVA又在多種酶的相繼催化作用下生成IPP[17]。HMGS和HMGR是MVA途徑的關鍵酶，其基因的表達影響著酶的活性，從而影響著萜類物質的生成。骨架形成階段是指DMAPP和IPP在一系列酶的催化下生成為2，3-氧化鯊烯，再經過氧化鯊烯環化酶(OSC)環化生成萜類骨架。修飾階段是指CYP450和糖基轉移酶(UGT)對萜類骨架進行氧化、置換、糖基化等一系列修飾以生成各種皂苷。

目前，HMGS和HMGR已在多種藥用植物中被克隆，如擬南芥[18-19]，丹參[20-21]，三七[22]等，但在桔梗物種中還未被克隆。張健等[23]對HMGS、HMGR基因在不同生長年限的桔梗根中的差異表達情況進行分析，發現HMGS和HMGR均在一年生桔梗根中表達最高。馬春花等[24]通過轉錄組測序、功能注釋及基因組織特異性表達分析，共鑒定出19個與桔梗三萜皂苷合成相關的關鍵基因，其中HMGS和HMGR基因分別在葉和根中表達最高。

本研究基于轉錄組數據首次克隆得到桔梗MVA途徑的關鍵酶基因PgHMGS和PgHMGR的全長序列，并進行相關生物信息學分析，構建重組表達載體，轉化到大腸桿菌進行異源表達，為揭示桔梗三萜皂苷類物質生物合成的分子機理提供理論依據。

1 材料

兩年生桔梗樣品于2019年采自安徽省桐城市，經安徽中醫藥大學彭華勝教授鑒定為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.。收集的樣品經液氮速凍后儲存于實驗室-80 ℃冰箱。

Trans1-T1、E.coliTransetta(DE3)、T載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、無縫拼接、切膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司；反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；pET-28a(+)、pET-32a(+)質粒購自武漢淼靈生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自美國Sigma公司; 實驗所需的各種酶購自英國Biolabs公司；實驗所需引物由上海生工生物有限公司合成。

2 方法

2.1 轉錄組分析組裝與RNA提取 通過華大測序平臺對桔梗樣品進行測序，測序所得的原始數據經過過濾軟件SOAPnuke的過濾[25]，去除接頭、去除未知堿基N含量大于10%及低質量的讀取，生成高質量的干凈讀取。使用Bowtie2將干凈讀取比對到參考基因序列，之后再使用RSEM計算基因和轉錄本的表達水平[26-27]。

取約80 mg新鮮桔梗根，加液氮置球磨機上研磨成粉，采用CTAB法提取總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，超微量紫外分光光度計ND2000測定桔梗總RNA的A260、A280值，總RNA經反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。

2.2PgHMGS,PgHMGR基因克隆 通過從NCBI中調取其他物種HMGS、HMGR基因序列，作為為模板從桔梗轉錄組數據中調取桔梗HMGS、HMGR，通過去除不完整、重復序列，篩選得到一條PgHMGS和一條PgHMGR。通過Primer軟件設計基因特異性引物。上游引物PgHMGS-F 5′-ATGGCTTCTAACCCGAAGAATGTTG-3′，PgHMGR-F 5′-ATG GACGTCCGATCAACCACCATCA-3′；下游引物PgHMGS-R 5′-TCAATGGCCATTGGCCACCGGTGCA- 3′，PgHMGR-R 5′-CTAAGCTTTGGAAACATCTTTGTTG-3′。以反轉錄后的桔梗cDNA為模板，采用高保真酶Phusion進行PCR擴增，擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。目的條帶使用切膠回收試劑盒回收。將切膠回收產物連接至T載pEASY-Blunt Zero，轉化至大腸桿菌Trans1-T1，接種氨芐青霉素抗性固體培養基上，挑取單菌落進行菌液PCR驗證，將陽性克隆菌液送至蘇州金唯智公司測序。

2.3PgHMGS,PgHMGR基因的生物信息學分析 菌液測序的序列結果與原序列比對成功后，使用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定基因序列的ORF區并通過在線工具BLAST對其核苷酸序列和氨基酸序列進行同源比對分析以確認克隆結果正確性；利用ExPASy(https://web.expasy. org/protparam/)預測基因編碼蛋白大小、氨基酸數目、等電點等理化性質；WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預測蛋白的亞細胞定位；NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預測蛋白的二級結構；Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)結合PyMOL軟件構建蛋白三級結構模型；CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cd d/wrpsb.cgi)分析蛋白序列的結構域；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/service s/TMHMM/)分析蛋白序列的跨膜結構域；從NCBI中獲取其他植物HMGS和HMGR基因的氨基酸序列，運用MEGA7.0軟件的ClustalW將PgHMGS和PgHMGR與其他植物氨基酸序列進行同源比對后構建Neighbor-joining系統進化樹(bootstrap重復次1 000次)。

2.4PgHMGS,PgHMGR基因的原核表達 對測序后的序列進行分析，設計含有BamH Ⅰ酶切位點的無縫拼接引物，上游引物PgHMGS-28a(+)-BamH I-F：5′-GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGCTTCTAACCCGAAGAA TGTTG-3′，PgHMGR-32a(+)-BamH I-F 5′-AGGCCATGGCTG ATATCGGAATGGACGTCCGATC AACCACCATCA-3′；下游引物PgHMGS-28a(+)-BamH I-R：5′-CGACGGAGCTCGAAT TCGGA TCAATGG CCATTGGCCACCGGTGCA-3′，PgHMGR-32a(+)-BamH I-R 5′-CGACGGAGCTCG AATTCGGACTA AGCTTTGGAAACATCTTTGTTG-3′。以重組質粒為模板，進行PCR擴增。用BamH Ⅰ限制性內切酶對pET-28a(+)和pET-32a(+)進行單酶切。目的基因片段與原核表達載體pET-28a(+)和pET-32a(+)使用無縫拼接試劑盒pEASY于50 ℃連接30 min，轉化至大腸桿菌Trans1-T1，接種到LB固體培養基上(卡那霉素或氨芐霉素抗性)，挑取單菌落進行菌液PCR陽性驗證、測序及質粒提取。將陽性重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，構建轉化表達宿主菌。按1∶100的比例取轉化菌液加入LB液體培養基中(卡那霉素或氨芐霉素抗性)，37 ℃，振蕩培養，至OD600=0.4～0.6，在0.8 mmol/L IPTG條件下，20 ℃ 誘導12 h，pET-28a(+)，pET-32a(+)空載作為陰性對照。取1 mL菌液作為全菌離心(10 000×g，3 min，4 ℃)，1 mL PBS清洗后離心收集菌體(10 000×g，3 min)，余下菌液離心(5 000×g，3 min，4 ℃)后用5 mL His Buffer A(20 mmol/L Na3PO4·12H2O、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑)重懸，置冰浴中超聲破碎、離心(10 000×g，15 min，4 ℃)后獲得上清，上述樣品加入上樣緩沖液，沸水煮8 min，經12% SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達。

3 結果

3.1 基因克隆及序列分析 基于桔梗轉錄組數據獲得PgHMGS和PgHMGR基因的cDNA序列，利用DNAMAN軟件結合ORF Finder對PgHMGS和PgHMGR基因cDNA序列進行分析，其ORF區分別為1 401、1 749 bp，分別編碼466、582個氨基酸。以桔梗cDNA為模板，PCR進行目的基因擴增，產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小與目的基因大小一致(圖1)。將PgHMGS和PgHMGR基因提交到NCBI使用在線軟件BLAST進行序列比對。PgHMGS和PgHMGR與GenBank中已注冊植物基因有較高的同源性，其中PgHMGS與三七HMGS(注冊號AGZ15317.1)的相似性為99.57%，PgHMGR與丹參HMGR(注冊號AEZ55672.1)的相似性為79.30%。

3.2 生物信息學分析 利用在線工具ExPASy對PgHMGS，PgHMGR基因編碼蛋白進行理化性質分析，預測PgHMGS的相對分子質量為51 384.26，編碼蛋白的理論等電點為5.83，不穩定系數為38.83，脂肪指數為74.33，負電荷殘基總數為54，正電荷殘基總數為46；預測PgHMGR相對分子質量為62 477.81，編碼蛋白的理論等電點為6.51，穩定系數為39.25，脂肪指數為95.02，負電荷殘基總數為54，正電荷殘基總數為51；初步推測PgHMGS，PgHMGR為穩定的酸性蛋白。利用在線軟件WoLF PSORT預測PgHMGS，PgHMGR分別定位于線粒體膜和內質網。

根據PgHMGS，PgHMGR基因的氨基酸序列，利用NPS在線軟件預測多肽鏈中氨基酸序列的二級結構(圖2)。NPS預測結果表明，PgHMGS，PgHMGR蛋白的二級結構都由α-螺旋、延伸鏈、無規則卷曲組成，其中無規則卷曲結構占比最大。PgHMGS的無規卷曲結構包含214個氨基酸，占比為45.92%，α-螺旋包含186個氨基酸，占比為39.91%，延伸鏈包含66個氨基酸，占比為14.16%；PgHMGR的無規卷曲結構包含258個氨基酸，占44.38%，α-螺旋包含231個氨基酸，占39.69%，延伸鏈包含93個氨基酸，占15.98%。兩種基因二級結構的規律均為無規卷曲>α-螺旋>延伸鏈。使用在線軟件SWISS-MODEL對PgHMGS，PgHMGR進行同源建模，構建其3D結構模型(圖2)。選擇芥菜Brassicajuncea(L.) Czern. et Coss. HMGS為模板(SMTL ID：2fa3.1)構建PgHMGS模型[28]，序列相似性為82.14%，整體評分為0.89；選擇肝HMGR為模板(SMTL ID：2r4f.1)構建PgHMGR模型[29]，序列相似性為57.14%，整體評分為0.79。

利用NCBI的 Conserved domains在線工具對PgHMGS，PgHMGR蛋白結構功能域進行分析。結果表明，PgHMGS的4～466 aa具有PLN02577家族(羥甲基戊二酰輔酶A合酶)的保守結構域，PgHMGR的171～574 aa具有HMG-CoA_reductase_classI家族(HMG-CoA還原酶)的保守結構域(圖3)。利用TMHMM在線工具預測PgHMGS，PgHMGR蛋白的跨膜結構域，結果表明，PgHMGS無跨膜結構，屬于膜外蛋白。PgHMGR有兩個跨膜結構域，分別位于54～76、96～118、77～95 aa位于膜內，1～53、119～582 aa位于膜外(圖3)。

利用DNAMAN軟件對PgHMGS和PgHMGR的氨基酸序列與其他植物基因進行氨基酸序列同源比對。將PgHMGS序列與三七PnHMGS(AIK21781.1)、洋常春藤HhHMGS(APY22353.1)進行多序列比對分析，三種HMGS基因的一致性為92.57%，都有保守的催化結構域GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL。將PgHMGR序列與茶CsHMGR(AEO12148.1)、丹參SmHMGR(AEZ55672.1)進行多序列比對分析，三種植物HMGR基因的一致性為77.83%(圖4)，均具有HMG-CoA底物結合區域(TTEGCLVA)和NADPH結合保守區域(DAMGMNM、GTVGGGT)。

從NCBI中下載了其他植物的HMGS、HMGR的氨基酸序列，采用MEGA7.0軟件采用鄰接法構建系統進化樹(圖5)。結果顯示，來源于不同物種基因的蛋白被聚成雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物和菌類。其中，PgHMGS與五加科植物三七、洋常春藤HMGS聚為一支，表明同源性較高。PgHMGR與唇形科植物丹參、山茶科植物茶聚為一支，具有較高同源性。

3.3 原核表達載體構建及誘導表達 將重組質粒pET-28a(+)-PgHMGS、pET-32a(+)-PgHMGR轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，菌液PCR驗證，陽性菌株測序驗證，證實目的基因已成功插入表達載體。同時，pET-28a(+)和pET-32a(+)轉入大腸桿菌BL21(DE3)作為陰性對照。在0.8 mmol/L IPTG，20 ℃誘導12 h條件下，觀察重組融合蛋白的表達。重組菌株表達后收集菌體并進行破碎裂解，上清液進行12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。電泳結果顯示，pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR的菌株和上清液分別在45、70 kDA處出現條帶，與預測結果一致(圖6)。

4 討論

目前，植物轉錄組學研究對植物活性成分合成途徑關鍵酶基因的挖掘已經成為研究熱點[30]，期望通過分子手段來實現植物藥用成分的大量積累。桔梗的藥用價值來源于桔梗三萜皂苷類成分。乙酰輔酶A在HMGS、HMGR的相繼催化下生成MVA，MVA的生成是一個不可逆過程，因此HMGR被認為是MVA途徑中的第一個限速酶[31]，對MVA途徑調控起重要作用。HMGS、HMGR基因的功能已經得到證實。王家典等[32]通過實驗證實雷公藤HMGR基因的過表達顯著增加了雷公藤懸浮細胞藤甲素和雷公藤紅素的含量。Kim等[33]采用HMGR競爭性抑制劑美維諾林處理四周生的人參不定根24 h后，人參不定根中人參總皂苷含量降低。芥菜HMGS基因在擬南芥中過表達上調了HMGR的表達，提高擬南芥的甾醇含量和脅迫耐受性，證明HMGS與HMGR可以相互協同共同來調節MVA代謝通路[34]。

本研究克隆得到PgHMGS和PgHMGR，其基因長度分別為1 401、1 749 bp，推測分別編碼466、582 aa，均為酸性穩定蛋白。生物信息學分析表明PgHMGS不具有跨膜結構，為膜外蛋白，與厚樸[35]、桑黃[36]HMGS蛋白跨膜結構預測結果一致。亞細胞定位預測PgHMGS在線粒體膜上起作用。PgHMGS與三七、洋常春藤HMGS氨基酸序列同源性比對結果顯示序列具有92.57%的高度相似性，且都具有由21個氨基酸組成的保守催化結構域(GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL)[37]，表明不同物種間的HMGS具有高度的保守性。通過分析發現PgHMGR具有兩個跨膜結構域，與茅蒼術[38]、羅漢果[39]HMGR蛋白跨膜結構預測結果一致。預測PgHMGR定位于內質網，推測該蛋白可能為某種物質的膜受體或者參與內質網的物質運輸[40]。PgHMGR與丹參、茶HMGR同源性比對顯示序列相似性為77.83%。通過序列分析發現，桔梗、丹參、茶3種植物的HMGR均包含1個底物HMG-CoA結合區域(TTEGCLVA)和2個NADPH結合區域(DAMGMNM和GTVGGGT)。PgHMGR發揮酶催化作用時，連同NADPH作為反應供氫體一起催化HMG-CoA生成MVA，首先一分子的NADPH還原形成半縮硫醛中間體，然后分解、質子化，最后NADPH替代NADP+將聚乙醛還原為MVA[41]。

解析藥用植物活性成分合成途徑，通過分子手段實現大批量藥用成分的生產，可以提高藥用植物利用率。本研究成功克隆桔梗MVA途徑的HMGS和HMGR基因并進行生信分析，同時構建了重組質粒pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR，將其導入大腸桿菌中進行原核表達，成功誘導出可溶性蛋白，為進一步研究桔梗HMGS、HMGR基因的體外功能奠定基礎，也為進一步研究桔梗中三萜類成分的生物合成提供物質基礎。