水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡證相關(guān)指標的干預作用

楊 帆， 李雅純， 郭 帥， 陳志強,2*

(1.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050091；2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管病并發(fā)癥之一，其發(fā)病率正逐年上升，據(jù)國外報道，20%～40%的糖尿病患者合并糖尿病腎病[1-2]。而我國糖尿病腎病導致終末期腎病的比例也日漸增加，現(xiàn)已成為中老年人終末期腎病的首要原因[3]。

中醫(yī)學認為瘀血阻滯腎臟絡脈是糖尿病腎病的主要病機之一[4]。因此，化瘀通絡、消除絡脈瘀血是治療糖尿病腎病之關(guān)鍵。然而絡病之瘀多病根深伏，病情頑纏，屬沉疴痼疾，非一般草木之品所能取效，必藉以蟲類藥搜邪剔絡，因蟲類之品為血肉之質(zhì)，又有動躍攻沖之性，體陰用陽，能深入隧絡，直達病所，攻剔痼結(jié)之瘀痰，旋轉(zhuǎn)陽動之氣，從而使絡痹易開，結(jié)邪易去。為此，本實驗選擇了“在破血藥中功列第一，只破瘀血而不傷新血”的水蛭作為研究對象。課題組前期研究已經(jīng)證實了糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡證的存在[5]，故本實驗以此大鼠模型為基礎，通過灌胃給予水蛭凍干粉，觀察其對糖尿病腎病大鼠瘀血阻絡證相關(guān)指標的干預作用。

1 材料

1.1 動物 48只雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量60～80 g，4～5周齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號SCXK(京)2016-0006。大鼠在溫度(24±1)℃，相對濕度50%～70%條件下，給予普通飼料，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 試劑與藥物 水蛭凍干粉(批號Z10970056)，購自重慶多普泰制藥股份有限公司，每1克水蛭凍干粉相當于56個抗凝血酶活性單位。鏈脲佐菌素(STZ，批號04081408)，購自美國Enzo Life Sciences公司；大鼠尿蛋白定量測試盒(批號C035-2-1)，購自南京建成生物工程研究所；大鼠纖維蛋白原(vWF)ELISA試劑盒(批號F1713)，購自上海西唐生物科技有限公司；大鼠P選擇素ELISA試劑盒(批號SXR058)，購自上海森雄科技實業(yè)有限公司；高脂飼料(蛋白質(zhì)24.2%，碳水化合物42.1%，脂肪25.4%，總熱量比4.7 kcal/g)、普通飼料(蛋白質(zhì)21.1%，碳水化合物60.6%，脂肪4.5%，總熱量比3.6 kcal/g)，購自北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 DT-2000型電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)；大鼠代謝籠(上海科端生物科技有限公司)；穩(wěn)豪型血糖儀[強生(中國)有限公司]；全自動血細胞分析儀(日本Sysmex公司)；ACLTOP700型凝血分析儀(美國Beckman公司)；7600-020型全自動大型生化分析儀(日本日立公司)；全自動血液流變儀(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)；MICROM-340E型石蠟切片機(德國Zeiss公司)；TEC-2800自型動組織包埋機(上海精密儀器儀表有限公司)；全自動酶標儀(美國BioTek公司)；BX63+DP72型正置研究級顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 模型建立 采用隨機數(shù)字表法隨機選取8只大鼠作為正常組，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余40只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)6周后禁食不禁水12 h，腹腔注射1%新鮮配制的STZ溶液(35 mg/kg)，正常組大鼠腹腔注射等體積溶媒(0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.3)，72 h后尾靜脈取血測量血糖值，隨機血糖≥16.7 mmol/L視為糖尿病造模成功[6]。其中血糖不達標者1只，死亡2只，予以剔除。

2.2 分組及給藥 將造模成功的大鼠隨機分為模型組(10只)，水蛭凍干粉低、中、高劑量組(各9只)，造模成功后隨即給予藥物干預，其中水蛭凍干粉低、中、高劑量組分別灌胃給予0.3、0.6、1.2 g/kg水蛭凍干粉[7-8]，正常組及模型組灌胃給予等量飲用水，連續(xù)給藥16周。

2.3 標本收集 大鼠于注射STZ后第3天及藥物干預第4、8、12、16周放入代謝籠，自由飲食，留取24 h尿液，并計錄各組大鼠體質(zhì)量、飲水量、尿量。水蛭凍干粉干預16周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)深度麻醉，仰臥位固定后，股主動脈穿刺取血待測。剖開腹腔，快速取出大鼠腎臟，剝?nèi)ケ荒ぃQ定質(zhì)量，留取部分腎皮質(zhì)于4%中性甲醛溶液中固定，用于組織染色及病理觀察。

2.4 檢測指標

2.4.1 一般情況 觀察各組大鼠注射STZ后第3天及藥物干預第4、8、12、16周體質(zhì)量、飲水量、尿量變化情況。

2.4.2 24 h尿蛋白定量 將大鼠尿液于4 ℃、3 500 r/min條件下離心10 min，取上清，按照尿蛋白定量試劑盒說明檢測尿蛋白水平，根據(jù)大鼠24 h尿量計算24 h尿蛋白定量。

2.4.3 腎臟指數(shù) 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后稱定各組大鼠體質(zhì)量，剖開腹腔快速剝離腎臟被膜，冰冷的生理鹽水沖洗后，稱定右腎質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)。

2.4.4 腎功能、血脂水平 采用全自動大型生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿酸(UA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平；采用凝血分析儀檢測血漿凝血酶原時間(PT)、國際標準化比值(INR)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、血漿纖維蛋白原(Fib)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)水平。

2.4.5 血液流變學 將部分血液注入含肝素抗凝劑試管，使血液和抗凝劑混勻，采用全自動血液流變分析儀檢測大鼠血液流變學變化。

2.4.6 血漿可溶性P選擇素、vWF水平 將部分血液于4 ℃、1 500 r/min條件下離心10 min，分離得到血漿，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測各組大鼠血漿vWF、可溶性P選擇素水平。

2.4.7 腎組織病理形態(tài)學 腎臟組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(4 μm)后，分別用蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色，通過光學顯微鏡以盲法進行腎組織的形態(tài)學評估，并應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測Masson染色的腎臟病理切片的膠原沉積量。

3 結(jié)果

3.1 水蛭凍干粉對大鼠一般情況的影響 正常組大鼠體質(zhì)量增加，反應靈敏，活動自如，毛色光亮潔白；模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食，形體消瘦，反應遲鈍，精神萎靡，毛色枯黃無光澤，并且部分大鼠出現(xiàn)膿瘡、腹部包塊等；水蛭凍干粉組上述情況有明顯改善，體質(zhì)量增加，活動量增加，毛色變白有光澤。在藥物干預過程中模型組大鼠死亡3只，水蛭凍干粉低劑量組大鼠死亡2只，水蛭凍干粉中、高劑量組大鼠各死亡1只。

3.2 水蛭凍干粉對大鼠體質(zhì)量的影響 STZ注射后3 d，各組大鼠體質(zhì)量比較無明顯變化(P>0.05)；正常組大鼠體質(zhì)量隨時間增長逐步增加，與同時間點正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.01)；與同時間點模型組比較，16周后水蛭凍干粉中、高劑量組大鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)，而水蛭凍干粉低劑量組大鼠體質(zhì)量有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 水蛭凍干粉對大鼠體質(zhì)量的影響

3.3 水蛭凍干粉對大鼠飲水量的影響 與同時間點正常組比較，模型組大鼠飲水量增多(P<0.01)；與同時間點模型組比較，12周后水蛭凍干粉中、高劑量組大鼠飲水量減少(P<0.05，P<0.01)，16周低劑量組大鼠飲水量減少(P<0.05)，見表2。

表2 水蛭凍干粉對大鼠飲水量的影響

3.4 水蛭凍干粉對大鼠尿量的影響 與同時間點正常組比較，模型組大鼠尿量增多(P<0.01)；與同時間點模型組比較，12周后水蛭凍干粉中、高劑量組大鼠尿量減少(P<0.05，P<0.01)，16周低劑量組大鼠尿量減少(P<0.05)，見表3。

表3 水蛭凍干粉對大鼠尿量的影響

3.5 水蛭凍干粉對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量、腎臟指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組大鼠BUN、Scr、UA水平，24 h尿蛋白定量，腎臟指數(shù)均升高(P<0.01)；與模型組比較，水蛭凍干粉各劑量組BUN、Scr、UA水平，24 h尿蛋白定量，腎臟指數(shù)均呈劑量依賴性降低(P<0.05，P<0.01)，見表4。

表4 水蛭凍干粉對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量、腎臟指數(shù)的影響

3.6 水蛭凍干粉對大鼠腎組織病理形態(tài)學的影響 如圖1所示，正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，無毛細血管腔擴張，無腎小球肥大或萎縮，基底膜無增厚，系膜細胞無增生，腎間質(zhì)無炎性細胞浸潤；模型組大鼠腎小球體積增大，腎小囊腔變窄，基底膜彌漫增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮腫脹，管腔狹窄，炎性細胞浸潤，部分出現(xiàn)纖維化；與模型組比較，水蛭凍干粉各劑量組大鼠腎組織病理損傷均有一定程度減輕。如圖2所示，與正常組比較，模型組大鼠膠原纖維沉積增加(P<0.01)；與模型組比較，水蛭凍干粉各劑量組腎間質(zhì)及腎小球膠原沉積減少(P<0.01)。

3.7 水蛭凍干粉對大鼠空腹血糖、血脂水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，水蛭凍干粉各劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01)，F(xiàn)BG水平略有下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組大鼠血清HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 水蛭凍干粉對大鼠空腹血糖、血脂水平的影響

3.8 水蛭凍干粉對大鼠血液流變學的影響 與正常組比較，模型組大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度及紅細胞聚集指數(shù)均升高(P<0.01)；與模型組比較，水蛭凍干粉各劑量組大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度及紅細胞聚集指數(shù)水平均呈劑量依賴性降低(P<0.05，P<0.01)，見表6。

表6 各組大鼠血液流變學的比較

3.9 水蛭凍干粉對大鼠凝血功能的影響 與正常組比較，模型組大鼠PT、APTT、FIB，AT-Ⅲ、INR水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，水蛭凍干粉各劑量組大鼠PT、APTT、FIB，AT-Ⅲ、INR水平均降低(P<0.05，P<0.01)；各組大鼠血漿TT比較無差異(P>0.05)，見表7。

表7 水蛭凍干粉對大鼠凝血功能的影響

3.10 水蛭凍干粉對大鼠血漿可溶性P選擇素、vWF水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血漿可溶性P選擇素、vWF水平升高(P<0.01)；與模型組比較，水蛭凍干粉各劑量組大鼠血漿可溶性P選擇素、vWF水平均降低(P<0.01)，見表8。

表8 水蛭凍干粉對大鼠血漿可溶性P選擇素、vWF水平的影響

4 討論

糖尿病腎病病程綿長，遷延難愈，多為久病痼疾。久病多虛，久病入絡，氣虛無以推動血行形成瘀血導致腎絡瘀阻。現(xiàn)代研究也證實，糖尿病腎病患者幾乎100%存在瘀血的病理狀態(tài)[9]，且多存在糖脂代謝紊亂及凝血-纖溶系統(tǒng)紊亂[10]，血液流變學和血流動力學的異常[11-12]，內(nèi)皮細胞功能障礙[13]，血液理化性質(zhì)的改變。鑒于“瘀血阻絡”貫穿糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的始終[14-15]，因此，化瘀通絡、保持絡脈氣血通暢和腎絡無損是治療糖尿病腎病之關(guān)鍵。水蛭是常用的活血化瘀通絡中藥，主要含有蛋白質(zhì)及多肽類分子等抗凝血成分，此外還包含一些小分子化合物和微量元素[16]，其中水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凝血酶特異性抑制劑[17]。

高血糖是糖尿病的主要特征，脂代謝異常是糖尿病的獨立危險因素，而“脂質(zhì)”具有“腎毒性”[18]。腎小球系膜細胞中存在低密度脂蛋白受體，當?shù)兔芏戎鞍着c受體結(jié)合后可誘導系膜細胞增殖及基質(zhì)沉積[19]；同時低密度脂蛋白也可與腎小球基底膜上的負電荷相結(jié)合，使負電荷屏障破壞，從而增加了腎小球基底膜的通透性[20]。另外凝血指標的改變反映了血漿凝血酶及凝血因子活性增高，凝血酶能夠明顯促進腎小球系膜細胞和上皮細胞增殖[21]，同時可導致血液流變學異常，而血液黏度增高可進一步干擾腎臟微循環(huán)，加重其缺血缺氧狀態(tài)，繼而通過提高基底膜通透性加重血漿蛋白漏出[22]。本研究結(jié)果顯示，高脂飼料聯(lián)合小劑量腹腔注射STZ復制的糖尿病腎病大鼠存在明顯的糖脂質(zhì)代謝紊亂、血液流變學及凝血-纖溶功能異常；水蛭凍干粉能改善大鼠血液流變學及凝血-纖溶功能異常，糾正脂代謝紊亂，但對血糖水平無明顯影響。

長期的糖脂代謝紊亂可引起血小板功能異常、內(nèi)皮損傷及功能障礙[23-24]。P選擇素是細胞粘附分子選擇素家族的主要成分，是反映血小板活化的金標準[25]，與腎臟疾病關(guān)系密切[26]。高血糖能刺激血小板膜上高表達P選擇素，介導血小板與內(nèi)皮細胞、白細胞的粘附及微血管內(nèi)血栓形成。vWF是反映內(nèi)皮細胞損傷及功能障礙的敏感指標[27]，當血管內(nèi)皮細胞受損時，vWF向循環(huán)血液中釋放增加并隨血液沉積在腎小球基底膜上，同時內(nèi)皮細胞表面vWF還可與血小板質(zhì)膜上的受體結(jié)合，介導血小板粘附于內(nèi)膜下基質(zhì)，增加微血栓形成，而微血栓形成勢必加劇血管內(nèi)皮細胞的損傷。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血漿可溶性P選擇素、vWF水平均升高；水蛭凍干粉干預后可溶性P選擇素、vWF水平降低，表明水蛭凍干粉能抑制血小板活化，減輕內(nèi)皮細胞損傷。

綜上所述，水蛭凍干粉可通過糾正脂代謝紊亂、改善大鼠血液流變學及凝血-纖溶功能異常，抑制血小板過度活化，減輕內(nèi)皮細胞損傷，進而改善大鼠多飲多尿多食癥狀，降低尿蛋白排泄，改善腎功能，減輕腎臟病理損傷，從而發(fā)揮腎臟保護作用。