短管兔耳草提取物對對乙酰氨基酚誘導小鼠藥物性肝損傷的保護作用與機制

毛 竹， 朱繼孝， 曾金祥， 吳茜娃， 任玲玲

(江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004)

藥物性肝損傷是指藥物本身或/和其活性代謝產物所致的肝損傷，其與10%急性肝炎、50%以上急性肝衰竭、4%住院性黃疸有關[1]。近年來，我國藥物性肝損傷的發病率已超過西方發達國家，成為嚴重威脅人們身體健康不可忽視的公共衛生問題[2]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)、異甘次酸鎂、糖皮質激素、水飛薊素、甘草酸和S-腺苷基甲硫氨酸常用于治療急性藥物性肝損傷[3-5]，但NAC治療窗口窄且具有嚴重的胃腸道毒副作用[3-4]，而其它藥物是否可成功防治藥物性肝損傷仍然存在疑問[5]。

中草藥及其成分對藥物性肝損傷具有良好的療效[6-9]，為篩選抗藥物性肝損傷藥物提供了重要途徑[10]。藏藥短管兔耳草系玄參科兔耳草屬植物LagotisbrevitubaMaxim.的干燥全草，為藏藥“洪連”的基原植物之一，具有清熱解毒、行血調經之功效[11]。現代藥理學研究表明短管兔耳草具有降尿酸、抗痛風、改善阿爾茨海默病癥、調節小鼠免疫功能、抗腫瘤等多種活性[11-15]。本課題組前期研究發現短管兔耳草可通過清除自由基、抑制脂質過氧化反應、調控炎癥因子等途徑，有效防治急性酒精性肝損傷、α-異硫氰酸萘酯致肝損傷、四氯化碳致肝損傷[16-18]。最新研究表明，TLR4/NF-κB信號通路對肝損傷疾病的防治具有重要研究意義[19-21]?；诖?，本研究通過TLR4/NF-κB通路繼續探討短管兔耳草提取物對對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)致藥物性肝損傷的保護作用及機制，以期為抗藥物性肝損傷的新藥開發提供一定的物質與理論基礎。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康雄性昆明種小鼠，體質量(20±2)g，購自江西中醫藥大學動物實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK(贛)2018-0003，自由飲水，適應性喂養7 d后進行實驗，本實驗符合江西中醫藥大學動物倫理委員會標準。

1.2 藥材 短管兔耳草購于成都荷花池藥材市場，經江西中醫藥大學鐘國躍研究員鑒定為玄參科兔耳草屬植物短管兔耳草LagotisbrevitubaMaxim.的干燥全草。稱取短管兔耳草100 g，曬干粉碎，加入10倍體積60%乙醇加熱回流提取2 h，過濾提取液，濾渣再同法提取2次，合并3次提取液，用旋轉蒸發儀減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，得短管兔耳草提取物。以0.5%羧甲基纖維素鈉配制高、中、低劑量(給藥劑量按生藥計分別為4.0、2.0、1.0 g/kg，小鼠灌胃容量為15 mL/kg)，給藥劑量參考文獻以及前期預實驗研究確定[16]。

1.3 試劑 對乙酰氨基酚試劑(批號099K0257)購自美國Sigma公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(批號R018043)購自上海易恩化學技術有限公司；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、考馬斯亮藍蛋白定量測定試劑盒(批號C009-2、C010-2-1、A001-3、A003-1、A005、A045-2)購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒(批號EMC102a、EMC001b)購自深圳欣博盛生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號G1120)購自北京索萊寶科技有限公司；NF-κB p65、TLR4(批號ab16502、ab024751)購自英國Abcam公司；GAPDH、二抗(批號10494-1-AP、SA00001-2)購自美國Proteintech公司。

1.4 儀器 BT25S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；RE5205旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；超低溫冰箱、Multiskan GO 全波長酶標儀(美國Thermo公司)；電熱恒溫烘箱(上海博迅實業有限公司)；DY89-Ⅱ電動勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Centrifuge 5430R低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；PowerPac Basic電泳儀、ChemiDoc XR+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；WD-9405B水平搖床(深圳沃德生命科技有限公司)；H1210撈片機、HistoCore Arcadia C切片機、TP1020-1包埋機(德國Lecia公司)；Nikon elipse ci-s 生物顯微鏡(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 將60只昆明種小鼠隨機分成6組，為正常組，模型組(APAP)，陽性藥物組(N-乙酰-L-半胱氨酸)，短管兔耳草提取物低、中、高劑量組(1.0、2.0、4.0 g/kg)，每組10只。短管兔耳草提取物組灌胃給予相應劑量藥物，陽性藥物組灌胃給予0.2 g/kgN-乙酰-L-半胱氨酸，正常組和模型組灌胃給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉，每天1次，連續7 d。第7天給藥1 h后，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余組小鼠腹腔注射250 mg/kg APAP(溶于生理鹽水)誘導藥物性肝損傷。造模后小鼠禁食不禁水，4 h后摘眼球取血，取血后脫頸處死小鼠，立即于冰臺上迅速取肝臟，用冷生理鹽水漂洗肝臟，每組取相同部位肝組織(肝大葉)固定于10%甲醛中，剩余肝組織置于-80 ℃冰箱保存備用。血液室溫下靜置1 h，3 500 r/min離心15 min，取血清，4 ℃冷藏備用[9,22]。

2.2 試劑盒檢測血清及肝組織各指標水平 按照試劑盒說明書操作，檢測血清中ALT、AST活性，TNF-α、IL-1β水平及肝組織中MDA水平，GSH-Px、SOD活性。

2.3 HE染色觀察肝組織病理學變化 取固定好的小鼠肝組織，置于包埋盒中流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸臘，包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察肝臟病理學變化。

2.4 Western blot檢測小鼠肝組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達 取50 mg肝組織加1 mL 2%SDS勻漿，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA定量測定蛋白樣品濃度。根據濃度制備樣品后進行常規電泳，再將蛋白質轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗GAPDH(1∶5 000)、TLR4(1∶3 000)、NF-κB p65(1∶5 000)4 ℃下孵育過夜，洗膜3次，二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，洗膜3次，用ECL發光底物進行顯影，采用Image Lab軟件對所得蛋白質條帶進行定量分析。

3 結果

3.1 短管兔耳草提取物對小鼠血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平的影響 如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，陽性藥物組和短管兔耳草提取物各劑量組血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05，P<0.01)，表明短管兔耳草可有效預防APAP致藥物性肝損傷小鼠的肝損傷。

表1 短管兔耳草對小鼠血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平的影響

3.2 短管兔耳草提取物對小鼠肝組織MDA水平及GSH-Px、SOD活性的影響 如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織MDA水平升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，說明APAP代謝形成的氧化應激產生了較大的肝損傷；與模型組比較，陽性藥物組和短管兔耳草提取物各劑量組MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05，P<0.01)，表明短管兔耳草提取物能有效減緩APAP致藥物性肝損傷小鼠的氧化應激。

表2 短管兔耳草對小鼠肝組織MDA水平及SOD、GSH-Px活性的影響

3.3 短管兔耳草提取物對小鼠肝組織病理學的影響 如圖1所示，正常組小鼠肝組織結構完整，肝小葉結構清晰，肝細胞排列整齊呈放射狀且核圓而清晰，肝組織無炎性細胞浸潤現象；模型組小鼠肝組織損傷嚴重，有大量炎性細胞浸潤，肝細胞索排列紊亂，肝細胞間無明顯界限，且大量肝細胞壞死；陽性藥物組能改善小鼠肝細胞排列，肝組織結構較清晰，炎性細胞浸潤及肝細胞壞死數量明顯減少；短管兔耳草提取物低劑量組肝索排列紊亂，肝細胞出現大量核增生及核固縮，大量肝細胞壞死；短管兔耳草提取物中、高劑量組肝組織結構較清楚，肝細胞出現部分核固縮，炎性細胞浸潤及肝細胞壞死數量明顯減少。以上結果表明，短管兔耳草提取物可有效改善APAP致藥物性肝損傷小鼠的肝臟病理學形態。

3.4 短管兔耳草提取物對小鼠肝組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.01)，說明APAP可激活TRL4/NF-κB p65信號通路；與模型組比較，短管兔耳草提取物各劑量組TLR4、NF-κB p65蛋白表達均降低(P<0.01)，說明短管兔耳草提取物對TLR4/NF-κB信號通路具有很好的抑制作用。

4 討論

APAP為臨床上常用的一種解熱鎮痛藥，由于其本身為非處方藥且常與其它藥物聯用，故極易因不規范性使用導致急性肝損傷甚至肝功能衰竭[23]。APAP誘導的肝損傷已成為篩選抗藥物性肝損傷藥物的理想模型[24]。APAP在過量使用情況下，經細胞色素P450酶(CYP450)代謝生成大量毒性產物N-乙酰對苯醌亞胺(NAPQI)，NAPQI在耗竭GSH之后，可與細胞膜上的蛋白結合，導致肝細胞損傷。同時，APAP還可誘導產生大量活性氧自由基(ROS)，消耗SOD、GSH-Px、GSH等抗氧化劑，導致人體內抗氧化系統失衡，觸發細胞內炎癥信號通路釋放炎癥細胞因子，最終導致肝細胞損傷，嚴重時會導致肝細胞壞死[25-26]。ALT、AST及MDA等是評價藥物性肝損傷程度的常用指標。當發生肝細胞發生損傷時，MDA水平升高，且細胞中ALT和AST會釋放到血清中導致血清中ALT和AST活性升高[7]。本研究顯示，短管兔耳草提取物能夠降低APAP誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性，降低肝組織MDA水平，表明短管兔耳草提取物對APAP致藥物性肝損傷具有一定的保護作用。短管兔耳草能提升肝組織SOD及GSH-Px活性，說明其可以通過改善氧化應激減輕APAP致藥物性肝損傷發揮肝保護作用[6,8]。

TLR4屬于細胞表面信號轉導跨膜受體，廣泛表達于Kupffer細胞、肝巨噬細胞、肝中性粒細胞及肝樹突狀細胞等多種肝細胞中，在免疫調節方面發揮著重要作用。NF-κB在細胞生長、凋亡和炎癥反應中發揮調節作用，是重要的核轉錄因子[19]。在病理狀態下，TLR4信號通路可激活一系列程序，包括使NF-κB p65轉移至細胞核內，使炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β釋放等[21]。其中，TNF-α由Kupffer細胞產生并由T細胞激活，是最主要的炎癥細胞調節因子[27]。而IL-1β由活化的巨噬細胞產生，在肝細胞壞死中起著重要作用[28]。這些釋放的炎癥因子表達過量又可反饋作用于NF-κB，繼而加重炎癥反應進一步加深肝組織的損傷[21]。因此，TLR4/NF-κB信號通路在抗肝損傷中起著重要作用[19-21]。本研究結果顯示，不同劑量短管兔耳草提取物均能抑制TLR4和NF-κB p65蛋白表達，使炎性細胞因子TNF-α及IL-1β水平降低，說明抑制TLR4/NF-κB信號通路降低炎癥因子水平是短管兔耳草提取物抗APAP誘導藥物性肝損傷的重要機制。

綜上所述，短管兔耳草提取物對APAP誘導藥物性肝損傷小鼠肝臟具有一定的保護作用，其機制與TLR4/NF-κB信號通路有關。目前基于TLR4/NF-κB通路對藥物性肝損傷的藥理及藥效物質研究仍不多見，本課題組將進一步對短管兔耳草化學成分及其藥效物質進行研究，為短管兔耳草基于TLR4/NF-κB通路抗藥物性肝損傷藥物開發提供實驗依據及物質基礎。