丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠繼發性炎癥的作用

楊小四， 姚文兵， 胡華麟， 劉 毅

(1.安慶醫藥高等專科學校醫學基礎部，安徽 安慶 246052；2.安慶醫藥高等專科學校藥學系，安徽 安慶 246052)

類風濕關節炎屬于多關節累積的滑膜炎性病變，炎癥刺激關節滑膜增生，新生血管形成，但確切病因未明[1]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路異常參與滑膜炎癥，針對該信號通路設計藥物靶點是目前治療類風濕關節炎的一個關注方向[2-3]。目前，臨床類風濕關節炎治療中常用的抗風濕藥、非甾體抗炎藥和糖皮質激素等均有一定局限性，生物制劑大多價格昂貴[4-5]。天然中草藥提取物因其在抗風濕中具有一定療效，價廉且副作用小而廣泛應用于類風濕關節炎治療[6]。毛莨科植物牡丹皮的提取物丹皮酚具有消炎作用，有文獻報道，其對實驗動物關節炎有抑制作用，可以抑制致炎細胞因子產生[7]，但其機制并不確定。佐劑性關節炎動物模型為免疫性關節炎性模型，其病程中動物表現的癥狀和病理變化類似于類風濕關節炎，被廣泛應用于類風濕關節炎研究[8]。本研究通過構建佐劑性關節炎大鼠模型，觀察丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠關節滑膜組織中p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表達的影響，探討丹皮酚改善佐劑性關節炎大鼠關節功能的部分機制，為中藥丹皮酚治療類風濕關節炎提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 健康成年雄性SD大鼠60只，體質量(210±10)g，購買并飼養于安徽省動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK(皖)2017-001，每籠5只，飼養環境為相對濕度(50±5)%，溫度(25±2)℃，采取燈光照明，明暗12 h/12 h交替，飼喂顆粒食用飼料，自由飲水。本實驗經安徽省動物實驗倫理委員會批準(倫理審查號AH.20190903c0600105)。

1.2 試劑與藥物 丹皮酚(純度>99%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號552-41-0)。p38 MAPK抑制劑SB203580(美國Cayman公司，批號13067-5)；弗氏完全佐劑(freunds complete adjuvant，FCA)(浙江聯碩生物科技有限公司，批號F5881)；水合氯醛(山東濟南嘉格生化科技有限公司，批號312-07-3)；大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司，批號KB1822、KB3911、KB2720)；蘇木精(北京索萊寶科技有限公司，批號H8070)；TRIzol(美國Invitrogen公司，批號19206038)；PCR逆轉錄試劑盒(美國Gene Copoeia公司，批號2037901801)；羊抗鼠p38 MAPK抗體、羊抗鼠β-actin抗體(美國Santa Cruz公司，批號SC00238、SC69879)；二抗兔抗羊辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白(Ig)G(北京華美生物技術公司，批號2020-07-29)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號AR0146)。

1.3 儀器 病理切片機(德國Leica公司，型號RM2235)；高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司，型號55362R)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號olympusix71)；酶標儀(美國Wisdom公司，型號6500)；實時熒光定量PCR儀(德國Roche 公司，型號LightCycler96)。

2 方法

2.1 動物分組、造模、給藥及標本處理 SD大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表分為對照組(10只)和佐劑性關節炎造模組(50只)。佐劑性關節炎動物模型制備依據文獻[9]報道，在大鼠左后肢足趾皮下注射FCA 0.1 mL，對照組注射等容量生理鹽水。致炎12 d后，50只造模組再隨機均分為模型組(生理鹽水)，丹皮酚低、中、高劑量組(8、16、32 mg/kg)，SB203580 組(2 mg/kg)，每組10只，灌胃給予相應劑量藥物，對照組灌胃給予等量生理鹽水，連續16 d。腹腔注射水合氯醛進行麻醉，抽取5 mL股動脈血，6 000 r/min離心10 min，分離得到血清，于-20 ℃冰箱保存。每組取3只大鼠踝關節做形態學研究，另7只踝關節滑膜組織作分子生物學研究。

2.2 繼發性關節炎的癥狀判定 根據課題組前期報道[10]，致炎12 d開始，每4 d觀察并記錄繼發性關節改變情況。主要觀察指標為①關節腫脹度，采用容積測量儀，排水法檢測大鼠右后肢(非致炎側)踝關節容積改變，公式為踝關節容積改變(ΔmL)=致炎后右后肢容積-致炎前右后肢容積。②關節炎指數，采用雙盲法三人觀察計分，計算除致炎側外其它關節情況，0分，關節無明顯結構變化；1分，某1個肢體關節輕微腫脹或有紅斑；2分，≥2個肢體關節輕微腫脹或有紅斑；3分，≥2個肢體關節腫脹或紅斑；4分，≥2個肢體關節明顯腫脹，站立不穩，計算3個關節累計得分，最高12分。

2.3 ELISA法檢測細胞因子水平 取大鼠血清，嚴格按照酶聯免疫吸附試劑盒說明書配置標準品和檢測溶液，根據操作步驟檢測血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平，酶標儀檢測波長為450 nm的吸光度(A)值。

2.4 踝關節p38 MAPK單克隆抗體免疫組化病理學檢查 10%福爾馬林充分固定踝關節后，經脫鈣、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，得到石蠟切片，脫蠟后微波抗原修復，H2O2室溫避光作用以消除內源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗羊抗鼠p38 MAPK單克隆抗體(1∶300)50 μL，4 ℃孵育過夜，次日滴加50 μL兔抗羊辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白(Ig)G二抗染液，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，經乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片后鏡檢，陰性對照采用PBS代替一抗染色，細胞質(或核)呈黃色或棕黃色為陽性顯色。采集圖像，南京捷達JD80i軟件分析圖像，參照文獻[10]報道計算p38 MAPK陽性細胞吸光度(A)值。

2.5 RT-qPCR檢測p38MAPKmRNA表達 取凍存大鼠滑膜組織塊并剪碎，采取TRIzol法提取RNA，檢測RNA濃度。嚴格按照反轉錄試劑盒說明書，將mRNA反轉錄為cDNA，PCR引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，p38MAPK正向序列5′-CGGTGTGTGCT GCTTTTGAT-3′，反向序列5′-CTGTAGCTTCCTTTTGGCGTG-3′；β-actin正向序列 5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，反向序列5′-GTTGGCATAGGTCTTTACGG-3′。RT-qPCR反應體系共20 μL，反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環45次。熔解曲線反應條件為95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，冷卻。實驗結果以2-ΔΔCT法表示。

2.6 Western blot檢測p38 MAPK蛋白表達 取凍存大鼠滑膜組織塊并剪碎行，加入10倍體積蛋白裂解液，充分裂解后提取滑膜組織中總蛋白，采取BCA法檢測蛋白濃度，然后加入蛋白上樣緩沖液，水浴鍋煮沸加熱3～5 min，冷卻后定量并制備上樣液進行SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜，脫脂奶粉液中室溫搖床封閉30 min，加入一抗p38 MAPK(1∶1 500)、β-actin(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗(1∶3 000)37 ℃孵育30 min，顯影與曝光，應用Image J軟件分析蛋白的灰度值。

3 結果

3.1 丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠繼發性關節腫脹的影響 與對照組比較，致炎12 d(給藥前)后，模型組大鼠繼發性足腫脹度增加(P<0.01)；與模型組比較，致炎16 d(給藥4 d)后，丹皮酚各劑量組和SB203580組均可抑制大鼠繼發性足腫脹(P<0.05，P<0.01)，其中丹皮酚高劑量組作用更為明顯，見圖1。

3.2 丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠繼發性關節炎指數的影響 與對照組比較，致炎12 d(給藥前)后，模型組大鼠非致炎側足趾開始腫脹，隨免疫時間延長而加重，直至大鼠站立困難，各時間點關節炎指數評分升高(P<0.01)；與模型組比較，致炎16 d(給藥4 d)后，丹皮酚各劑量組和SB203580組均有效改善癥狀，關節炎指數評分降低(P<0.05，P<0.01)，其中丹皮酚高劑量組降低關節炎指數更明顯，見圖2。

3.3 丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠血清炎癥因子水平的影響 與對照組比較，模型組血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)；與模型組比較，丹皮酚各劑量組和SB203580組IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.05，P<0.01)，見圖3。

3.4 丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠踝關節p38 MAPK蛋白表達的影響 對照組有少量p38 MAPK蛋白陽性表達；與對照組比較，模型組大鼠關節滑膜組織增厚，p38 MAPK蛋白陽性表達增加(P<0.01)；與模型組比較，丹皮酚各劑量組和SB203580組大鼠關節滑膜組織p38 MAPK蛋白陽性表達降低(P<0.05，P<0.01)，且隨著丹皮酚劑量的增加，p38 MAPK蛋白陽性表達下降，見圖4、表1。

表1 丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠踝關節p38 MAPK蛋白表達的影響

3.5 丹皮酚對佐劑性關節炎大鼠關節滑膜組織p38 MAPK mRNA和蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠關節滑膜組織p38 MAPK mRNA和蛋白表達均升高(P<0.01)；與模型組比較，丹皮酚各劑量組和SB203580組大鼠關節滑膜組織p38 MAPK mRNA和蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)，見圖5。

4 討論

中藥制劑在藥理中常具有多靶點、高安全性等優點，雷公藤多苷片[11]、青藤堿[12]、丹皮酚等抗炎、鎮痛作用顯著，常用于類風濕關節炎的治療。丹皮酚是中藥丹皮的提取物，具有涼血清熱、活血化瘀作用，文獻報道其有鎮痛、抗炎、清除自由基、抗氧化、抗過敏、解熱、抗腫瘤等多種功效[13]。本研究采取FCA局部注射大鼠足趾皮下構建佐劑性關節炎模型，是一種常見的類風濕關節炎動物模型，通過探究丹皮酚對佐劑性關節炎的影響，為丹皮酚在臨床上用于治療類風濕關節炎提供依據。研究表明，與模型組比較，第16、20、24、28天時，丹皮酚各劑量組大鼠繼發性足腫脹程度和多發性關節炎指數評分呈劑量依賴性降低，表明丹皮酚可有效抑制佐劑性關節炎模型大鼠繼發性炎癥，降低關節腫脹癥狀，且呈劑量依賴性。

在類風濕關節炎發病過程中，患者體內細胞免疫系統活化，激活單核-吞噬細胞系統，導致血清炎細胞分泌改變，IL-1β 和TNF-α等致炎因子水平升高，IL-1β往往作為炎癥的始動因素，刺激滑膜細胞和關節軟骨釋放前列環素E2和基質金屬蛋白酶等，加重滑膜炎癥反應，分解骨基質[14]; 同時，在類風濕關節炎的活動進展期，由單核-巨噬系統分泌的TNF-α呈高表達，且與疾病的嚴重程度呈正相關，驅動血液中性粒細胞和淋巴細胞向炎癥部位積聚，級聯機體炎癥反應[15]。本研究表明，丹皮酚可調節佐劑性關節炎大鼠中細胞因子水平，使得致炎因子IL-1β和TNF-α水平降低，抑炎因子IL-10水平升高，從而減輕佐劑性關節炎大鼠關節炎癥狀，包括減輕足腫脹，降低腫脹度和多發性關節炎指數，延緩佐劑性關節炎的發病進程。

近年來，越來越多實驗通過探討類風濕關節炎的病理機制而尋求中藥對其有效的治療方法[16]，其中p38 MAPK信號通路是炎性改變的經典通路[17-18]。本研究表明，丹皮酚干預佐劑性關節炎模型大鼠16 d后，關節和膜組織炎性反應顯著改善，關節表面滑膜組織和關節軟骨組織中p38 MAPK蛋白表達下降，且在基因和蛋白表達上均表現出類似的結果。同時，本研究發現，p38 MAPK信號通路阻斷劑SB203580可以改善佐劑性關節炎模型大鼠的關節炎癥狀，表明丹皮酚可能通過抑制p38 MAPK信號通路而改善佐劑性關節炎癥狀。

綜上所述，丹皮酚具有抑制p38 MAPK信號通路，從而抑制炎性因子分泌，保護關節軟骨和骨的作用，且呈劑量依賴性，本研究為丹皮酚治療類風濕關節炎提供了新的理論基礎。