黃精多糖對糖尿病小鼠的降血糖作用及機制

曾 立， 向 榮， 張運良， 傅春燕， 李庚喜， 李成艦

(1.邵陽學院，湘西南中藥開發利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽 422000；2.邵陽學院圖書館，湖南 邵陽 422000)

隨著生活方式和飲食結構的改變，我國糖尿病患者數已達1.14億，糖尿病逐漸成為亟待解決的嚴重公共衛生問題[1-2]。糖尿病顯著特征之一是空腹血糖值高于6.1 mmol/L或餐后2 h血糖值高于7.8 mmol/L，同時伴隨飲水增多、排尿增多、進食增多且體重消瘦的“三高一低”特征[3-5]。現有的雙胍類、格列奈類等六大類降血糖藥物雖已在臨床實驗中表現出了較好的降糖效果，但依然出現了諸如增加心血管疾病風險、胃腸道毒性等不良副反應[6]。因此，開發天然低毒性且具有良好抵御血糖升高的中藥對于防治糖尿病具有重要意義。已有研究表明，羅漢果苷可降低空腹血糖水平，同時改善血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，其降糖機制可能與恢復血脂水平有關[7]。黃芪甲苷提高了超氧化物歧化酶(SOD)的活性，同時抑制脂質氧化增加谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，從而發揮降血糖作用[8]。人參皂苷可能通過上調肝臟GSY等蛋白表達促進糖原合成，維持機體葡萄糖代謝穩態[9]。

黃精是常用的藥食同源中藥，具有多種生物活性物質，而黃精多糖是其主要活性成分之一。現有研究探討了黃精多糖提取物的降血糖效果[10-11]，但缺乏其對糖尿病動物模型肝組織糖代謝的影響。本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病小鼠模型，探究黃精多糖的降血糖效果及機制，為黃精多糖的深加工利用以及藥食同源中藥的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級昆明小鼠，體質量(20±2) g，共70只，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2020-0002，所有小鼠均按照邵陽學院學術委員會嚙齒類動物飼養標準進行處理。

1.2 試劑與藥物 黃精多糖(純度86.4%，批號J001982)購于上海將來實業股份有限公司。鹽酸二甲雙胍片、STZ(批號AAW1402、S0130)購于美國Sigma公司；TC、TG、SOD、GSH-Px、MDA和肝糖原(HG)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；E.Z.N.A Total RNA Kit試劑盒(批號R6688-01)購于美國Omega公司；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒、SYBR Green試劑盒(批號KR118、FP209)購于天根生化科技(北京)有限公司；β-actin、葡萄糖轉運蛋白-2抗體(GLUT2)、糖原合成酶激酶3β抗體(GSK-3β)；磷酸化糖原合成酶激酶3β 多抗體(p-GSK-3β)、磷脂酰肌醇1,2,3,4,5,-五磷酸抗體(PIP5K)、蛋白激酶B抗體(Akt)、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔抗體(批號66009-1-Ig、66846-1-Ig、22104-1-AP、14850-1-AP、55028-1-AP、16754-1-AP、22371-1-AP、SA00001-1、SA00001-2)均購于美國Proteintech公司。

1.3 儀器 多功能酶標儀、熒光定量RCP儀和高速勻漿機(美國Thermo公司)；5810型臺式冷凍離心機(德國Eppndorf公司)；電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；HH型數顯恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海醫用分析儀器廠)；UV-2550型紫外分光光度計(日本島津公司)；QuantStudio6型RCP儀(美國Lifetech公司)；電泳槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 造模 小鼠適應性飼養7 d，禁食16 h后測量空腹血糖值和體質量，根據體質量連續5 d腹腔注射50 mg/kg STZ溶液，每天1次，最后1次注射STZ后，禁食16 h并再次測定血糖值。同時，記錄造模期間小鼠的血糖值、飲水量、進食量和體質量。

1.5 分組及給藥 小鼠隨機分為6組，即正常組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、二甲雙胍組(250 mg/kg)及黃精多糖高、中、低劑量組(400、200、100 mg/kg)，除正常組外，其余各組均按“1.4”項下方法進行造模，各組灌胃給予相應劑量藥物，給藥容量為10 mL/kg，連續28 d，每7 d測定1次各組小鼠體質量和血糖值。第29 天，所有小鼠麻醉處死后摘眼球取血，并收集肝臟組織。

1.6 血清脂質水平、肝組織HG、MDA水平及SOD、GSH-Px活性檢測 全血于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取血清；肝組織勻漿后離心取上清，按試劑盒說明書檢測血清TC、TG、INS水平，肝組織中HG、MDA水平及SOD、GSH-Px活性。

1.7 RT-qPCR法檢測Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY、GSK-3βmRNA表達 按照Omega試劑盒說明書提取肝臟組織總RNA，按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒說明書將提取所得RNA樣品逆轉錄為cDNA(反應條件為42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min)，分裝后于-20 ℃保存，用于后續實驗。以cDNA為模板，使用委托北京擎科科技有限公司合成的引物(表1)進行實時熒光定量PCR擴增反應，觀察并分析熔解曲線。每個樣品設置3個復孔，以β-actin為內參，2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.8 Western blot法檢測Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY、GSK-3β蛋白表達 提取小鼠肝組織總蛋白，參考朱琪等[12]方法進行Western blot檢測。

2 結果

2.1 糖尿病小鼠模型的建立 觀察發現，模型組飼養箱內墊料潮濕，是排尿增多的表現。如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖值升高(P<0.01)，出現進食、飲水量增多(P<0.01)，但體質量卻減輕(P<0.05)的生理反應，表明造模成功。

2.2 黃精多糖對糖尿病小鼠血糖的影響 由表2可知，與正常組比較，模型組小鼠血糖水平升高(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組第7～28 天血糖水平均降低(P<0.05，P<0.01)，其中黃精多糖高劑量組效果較優。

表2 黃精多糖對小鼠血糖的影響

2.3 黃精多糖對糖尿病小鼠血清TC、TG、INS及肝組織HG水平的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG水平均升高(P<0.01)，血清INS和肝組織HG水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組小鼠血清TC、TG水平均降低(P<0.05，P<0.01)，血清INS和肝組織HG水平均升高(P<0.05，P<0.01)，其中黃精多糖高劑量組效果較優。

2.4 黃精多糖對糖尿病小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05，P<0.01)，MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，說明黃精多糖可能通過緩解氧化應激以及因氧化應激造成的糖代謝異常，調節葡萄糖的氧化分解，達到調節血糖的作用。

2.5 黃精多糖對糖尿病小鼠肝組織中參與糖代謝關鍵基因表達的影響 由圖4可知，與正常組比較，模型組小鼠肝組織Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表達均降低(P<0.01)，GSK-3βmRNA表達升高(P<0.01)，說明糖尿病小鼠胰島素受體信號轉導障礙，葡萄糖利用率和轉運能力降低，葡萄糖合成糖原的能力減弱；與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組均能上調Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表達(P<0.05，P<0.01)，下調GSK-3βmRNA表達升高(P<0.05，P<0.01)，說明黃精多糖可能通過上調PI3K提高胰島素與IRS1結合能力并激活Akt，改善機體胰島素信號的轉導，且對葡萄糖轉運能力和糖原合成能力均有改善作用。

2.6 黃精多糖對糖尿病小鼠肝組織中參與糖代謝關鍵蛋白表達的影響 如圖5所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織中Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY蛋白表達均降低(P<0.01)，GSK-3β蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組均能上調Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY蛋白表達(P<0.05，P<0.01)，下調GSK-3β蛋白表達(P<0.05，P<0.01)，說明黃精多糖提高胰島素與胰島素受體結合能力的同時，促進糖原合成和葡萄糖的轉運，改善機體血糖水平。

3 討論

糖尿病的病因和發病機制復雜，已被證實的病因包括有胰島素分泌不足以及胰島素缺陷作用等，從而誘發肝臟胰島素抵抗、肝糖原合成降低[13-15]。現代西藥包括促胰島素分泌劑類、胰島素增敏劑、磺脲類藥物、雙胍類等均被應用于治療糖尿病。臨床實驗已證明這些藥具有顯著的降血糖效果，但存在增加心血管疾病風險、肝腎功能減退、過敏反應、胃腸道毒性等一系列不良反應或并發癥[6]，如何有效防治糖尿病并且降低糖尿病并發癥,從而減輕患者的痛苦，已成為全世界關注重點[16]。部分中藥具有降血糖的作用，在降低患者血糖水平的同時，還可防治糖尿病的并發癥，在現有的中藥資源基礎上，開發更高效、更安全、更廉價的防治糖尿病的中藥活性成分成為熱點[17-19]。本實驗結果表明，各劑量黃精多糖均能起到降血糖的效果。高TC、TG水平是糖尿病患者特點之一，同時也能提示心血管疾病的發生[20]。各劑量黃精多糖均能改善糖尿病模型小鼠血清TC、TG水平，同時，還能改善血糖，血清中INS，肝臟中SOD、GSH-Px活性和MDA、HG水平，說明黃精多糖可在一定程度上通過改善糖脂代謝和緩解氧化應激等途徑調節糖脂代謝、降低血糖。肝臟是葡萄糖代謝和調節血糖濃度的主要器官之一，通過磷酸戊糖途徑、糖異生途徑等維持機體內血糖濃度穩定[21]。胰島素在維持血糖平衡的過程中具有關鍵性作用，其中Akt/PI3K信號通路被認為是胰島素發揮調控血糖作用的關鍵靶點，許多研究表明，通過干預PI3K-Akt等通路可達到降血糖作用[22-23]。本研究結果顯示，黃精多糖能上調PI3K、Akt、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表達，說明黃精多糖能通過激活IRS1-PI3K-PDK1-Akt信號通路，提高胰島素分泌并促進胰島素與胰島素受體相結合，提高機體消耗葡萄糖的能力[24-25]。而文獻研究表明，肝臟內Akt和GSK-3β磷酸化后可激活GSY，促進糖原合成[26-28]。本研究證明，黃精多糖通過激活PI3K-Akt-GSK-3β-GSY信號通路促進肝臟內消耗葡萄糖合成糖原。此外，活化的Akt也能作用于PIP5K和GLUT2，調控機體對葡萄糖的轉運與吸收[29-30]。黃精多糖通過激活PI3K-Akt-PIP5K-GLUT2促進葡萄糖的轉運，提高葡萄糖的利用和轉化，增加外周組織對葡萄糖的利用。

綜上所述，黃精多糖能通過降低肝臟中SOD、GSH-Px活性和MDA水平緩解機體氧化應激造成的糖代謝紊亂，能通過激活肝臟中IRS1-PI3K-PDK1-Akt、PI3K-Akt-GSK-3β-GYS、PI3K-Akt-PIP5K-GLUT2信號通路改善機體血糖水平，具有預防糖尿病的作用。