微性狀鑒別法鑒別紫錐菊

呂緒楨， 孫四海， 李俊強， 景奉堂， 張?zhí)煲伲?馮 帥,4*， 李 峰,4*

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.聊城市人民醫(yī)院藥學部，山東 聊城 252000；3.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264000；4.山東省高校中藥質量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟南 250355)

紫錐菊來源于菊科植物松果菊屬紫錐菊Echinaceapurpurea(L.) Moench的干燥地上部分[1]，在北京、山東、上海等多地引種?！睹绹幍洹分袑⒌纤晒?、狹葉紫錐菊和紫錐菊的根與根莖作為紫錐菊藥材來源。國內(nèi)紫錐菊多用于治療雞、鴨、豬等動物的病毒感染和提高動物的免疫力[2-3]。紫錐菊有強效的抗呼吸道合胞病毒作用[4]。紫錐菊原材料質量的不一致性導致產(chǎn)品質量的不穩(wěn)定性[5]，臨床前和臨床研究并未證明產(chǎn)品之間的藥理等效性[6-9]。因此，鑒別控制紫錐菊品種質量具有重要意義。

本研究利用常規(guī)攝影技術、微性狀拍攝技術[10-14]、顯微圖影拼接技術及實時景深擴展成像技術對紫錐菊藥材的微性狀及顯微特征進行彩色影像數(shù)據(jù)采集[15]，對16批紫錐菊進行生藥學研究。

1 材料

間苯三酚(批號BR30443)、蘇丹Ⅲ(批號XY21228)、水合氯醛(批號Q/12HB4218-2017)、菊苣酸(批號111752-201703)，上海源葉生物科技有限公司；濃硫酸、濃鹽酸、丙三醇(批號GB687-77)；甲醇，美國賽默飛公司。

CX41RF顯微鏡(上海賴氏電子科技有限公司)；SZM-45 T體視顯微鏡(深圳市方特科技有限公司)；顯微成像系統(tǒng)、WFH-203C四用紫外分析儀(上海馳唐實業(yè)有限公司)。

16批紫錐菊藥材(兩年生)經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為菊科植物松果菊屬紫錐菊Echinaceapupurea(L.) Moench的全草。新鮮藥材均于盛花期采收后放于4 ℃冰箱保鮮，藥材曬干后放于干燥通風避光處，見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 微性狀鑒別 利用高清體視顯微鏡對紫錐菊藥材根、莖、葉、花部位的微性狀特征進行觀察，采用實時景深擴展與拼接成像技術進行拍攝，獲取彩色影像數(shù)據(jù)[16-17]。

2.2 顯微鑒別研究 取紫錐菊做定位徒手切片、刀挫粉末制片。經(jīng)水合氯醛裝片。利用間苯三酚和濃鹽酸、濃硫酸、蘇丹Ⅲ溶液、90%乙醇確定特征結構。采用大圖影像拼接結合實時景深擴展成像技術進行拍攝，獲取彩色影像數(shù)據(jù)。

2.3 理化鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取紫錐菊藥材粉末(過40目篩)2.5 g，加40%甲醇50 mL于250 mL具塞錐形瓶中，稱重，超聲30 min，離心，取上清液，作為供試品溶液(S1-S16)。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取1.00 mg菊苣酸，放置于1 mL棕色量瓶內(nèi)，加入甲醇定容至刻度，混合均勻后備用，作為對照品溶液。

2.3.3 薄層層析 硅膠GF254薄層預制板在110 ℃中活化0.5 h，毛細管點樣對照品溶液、供試品溶液各5 uL，分別點在活化好的預制薄層硅膠板上。以乙酸乙酯∶甲酸∶水(6∶0.5∶1)為展開劑，展開至9 cm，取出薄層板晾干后置365 nm紫外燈下觀察。

3 結果

3.1 微性狀鑒別

3.1.1 根微性狀 主根呈圓錐狀，長15～25 cm，直徑1.5～3 cm，上部常有紫紅色葉柄殘基。棕褐色，粗糙，表面有黑色斑點，上部或全體有疏淺斷續(xù)的紫黑色橫環(huán)紋及縱皺紋深溝，側根較發(fā)達，密生須根，有多數(shù)須根痕，須根上多有白色柔毛。質硬，易折斷，斷面粗糙，圓形，皮部棕黃色，其上常有空腔，含有橘黃色油狀物，形成層環(huán)棕黃色，木部黃白色，靠近皮部可見黃棕色環(huán)狀分泌物，多數(shù)點狀導管小孔放射狀排列，射線形成放射狀紋理，表面偶見綠色。氣芳香，味初甜而后苦，微麻舌。見圖1。由表2可知，甘肅省、陜西省、安徽省根表面黑色斑點較少，白色絨毛密集，斷面皮部空腔較少。而廣東省根白色絨毛稀疏。山東省、河北省、河南省根表面黑色斑點較多，有明顯的紫黑色橫環(huán)紋及縱皺紋深溝，斷面皮部含有較多空腔。

3.1.2 莖微性狀 莖(圖2)圓柱形，表面綠色，具縱向棱線，中部以上分枝較多，長50～100 cm，直徑0.5～2 cm，被白色貼伏糙毛，表面具紫褐色或深綠色線性皮孔樣縱向斑點。莖橫切面類圓形，外被透明角質層。皮部墨綠色環(huán)列，木部淡綠色呈半月形環(huán)列，大小相伴排列，木部導管小孔徑向排列，清晰可見，皮部與木部約占橫切面1/4，干燥莖皮部與木部易分離。髓部呈白色，排列疏松,占橫切面的3/4,外側可見黃棕色斑點環(huán)列。氣微、味淡。由表2可知，甘肅省、陜西省莖為淺綠色，白色貼伏糙毛密集，皮孔樣縱向斑點少。其它產(chǎn)地莖為綠色，有白色貼伏糙毛，皮孔樣縱向斑點較多。

3.1.3 葉微性狀 莖生葉綠色或灰綠色，卵形至寬披針形，頂端漸尖，通常具稀疏鋸齒，有的全緣，葉柄長0.5～1.5 cm?；~墨綠色細長，卵形或三角狀卵形，長7～25 cm，寬2～7 cm，葉柄長5～25 cm。兩種葉片上下表面及主脈均有白色直立的糙毛，下表面糙毛多于上表面。見圖3。由表2可知，甘肅、陜西與安徽葉為綠色，鋸齒明顯，表面糙毛密集，而廣東省葉表面糙毛稀疏。山東、河北、河南葉多為灰綠色，葉邊緣具稀疏鋸齒，少數(shù)全緣，葉表面具糙毛。

3.1.4 花微性狀 花序頂生，頭狀花序(圖4)呈放射狀，舌狀花基生于花托，8～21余朵，粉色或紫紅色，狹長橢圓形，頂端2～3裂，全身被有稀疏不等的細密毛絨，花后期自基部向下折?；ㄍ袌A錐形或圓盤形?？偘P狀，覆瓦狀排列，綠色或棕綠色，常為 5 層，披針形至卵狀披針形，上表面近革質，下表面被有絨毛，中間數(shù)層先端外折。管狀花托片龍骨狀，宿存，長于管狀花，頂端較尖，自基部到頂端依次為綠色、橘黃色、紫色。堅硬無毛，2～4列，每列15～50不等，著生于花托上。管狀花(圖4)多數(shù)，與托片聯(lián)合。管狀花縱剖可見，花冠先端5裂，裂片三角形，其上有小突起，下部聯(lián)合成筒狀，呈紫紅色或黃白色。綠色小萼片包圍著花冠。聚藥雄蕊，花藥聯(lián)合，花粉黃色，花絲為5彼此分離?；ㄖ氶L，上部柱頭二裂，彎曲成倒鉤狀，被有長短不一的絨毛；子房下位，內(nèi)部可見一胚珠。果實為連萼瘦果，具三棱。早期種子黃白色，成熟后棕褐色或雙色，子葉兩枚。種子氣微，破碎后味辛辣。由表2可知，甘肅、河南舌狀花為紫紅色，總苞片絨毛密集。其它產(chǎn)地舌狀花為粉色，總苞片絨毛較密集。

表2 紫錐菊藥材微性狀差異

3.2 顯微鑒別 紫錐菊粉末，黃綠色。石細胞淡黃色或無色，呈梭形、方形、類圓形，長52～126 μm，內(nèi)含黃色物質或棕紅色物質；導管類型為網(wǎng)紋導管或梯狀網(wǎng)紋導管和具緣紋孔導管，螺紋導管多破碎，直徑18～52 μm；韌皮纖維，直徑11～20 μm，長梭形細胞壁厚具孔溝；木纖維短，直徑6～10 μm，呈不規(guī)則梭形壁上無孔溝。兩種纖維細胞內(nèi)部均有密集紋孔；莖表皮細胞多角形壁多平直，外表面有平行狀線型紋理，類似指紋紋理，偶見不定式氣孔；髓薄壁細胞，無色，長方形且數(shù)目眾多，內(nèi)部紋孔成列密集散在；皮孔樣突起經(jīng)莖表皮縱切面偶見，表皮細胞突起形成橢圓形、圓形輪廓；非腺毛有3種，多細胞圓錐狀非腺毛，由2～5細胞組成，壁厚，基部細胞寬闊，先端銳尖或稍鈍，表面有疣狀突起。多細胞棒狀毛，細胞呈類方形，由4～6個細胞組成，壁薄，頂端鈍圓，存在于葉下表皮主脈，呈匍匐狀。分枝星狀毛，非腺毛形如樹枝狀，腺毛細長，放射性排列，每個分枝狀細胞頂端較尖，多存在于花萼下表面；木薄壁細胞橢圓形、長方形、壁增厚，多個細胞結合處呈連柱狀，細胞壁孔溝少，胞腔大，內(nèi)部紋孔密集，內(nèi)含棕黃色物質；柵欄組織為1～2列長方形細胞，第一列細胞通常較第二列細胞長，排列緊密；海綿組織呈圓形或不規(guī)則形，內(nèi)涵黃綠色細胞內(nèi)含物，偶與導管聯(lián)合；葉上表皮細胞的表面觀為不規(guī)則多角形，排列較為緊密，垂周壁稍波狀彎曲。葉下表皮細胞的表面觀呈不規(guī)則形，垂周壁呈深波狀彎曲。氣孔多為不定式，副衛(wèi)細胞3～5個[18]，保衛(wèi)細胞為半月形，下表皮氣孔數(shù)目多于上表皮；花粉粒數(shù)目較多，類圓形或橢圓形，直徑22～31 μm，無色或淡黃色，萌發(fā)孔3個，表面有刺狀或細顆粒狀突起，刺狀突起略粗；花柱頭表皮細胞分化成圓錐形單細胞毛，乳頭狀或圓點狀突起，先端尖或稍鈍；花冠頂端碎片棕色或黃棕色，表皮細胞向外呈圓鈍毛狀或乳頭狀突起，常有乳頭狀突起散在；花粉囊內(nèi)壁細胞呈長多角形或類圓形，外周壁增厚，平面觀呈圓形或橢圓形，兩端增厚部位呈點狀；總苞上表皮細胞呈長六邊形，表面角質層紋理不明顯，垂周壁多平直，細胞排列緊密，細胞壁連珠狀增厚，氣孔少見?？偘卤砥ぜ毎L多角形或多角形，垂周壁多彎曲，不定時氣孔分布密集，氣孔處角質層紋理呈放射狀，副衛(wèi)細胞3～5個；中果皮碎片細胞呈狹長方形或長多角形，排列緊密，壁略增厚，其上密布細小紋孔；內(nèi)果皮纖維表面含棕紅色色素，細胞呈類方形，排列緊密，無色素覆蓋處纖維呈長條形，細胞壁增厚，有密集紋孔溝和紋孔，胞腔小；種皮表皮細胞類多角形或不規(guī)則形，壁薄，排列整齊，垂周壁平直或彎曲。粉末特征圖見圖5。不同產(chǎn)地紫錐菊粉末顯微鑒別研究發(fā)現(xiàn)甘肅(S2、S3)、陜西(S4、S5、S7)非腺毛與葉片氣孔數(shù)均多于廣東產(chǎn)地(S13)。

3.3 理化鑒別 16批紫錐菊的薄層色譜見圖6。

4 討論

微性狀鑒別研究清晰地觀察到莖、葉以及管狀花的內(nèi)部結構，補充紫錐菊性狀彩色影像信息。甘肅、陜西、廣東省與其它省份藥材微性狀特征有所不同，推測與其地理環(huán)境、氣溫、濕度等有關。粉末發(fā)現(xiàn)表皮類皮孔樣突起，且發(fā)現(xiàn)多細胞棒狀毛多存在于葉下表面主脈上，呈匍匐狀；分枝星狀毛存在于花萼下表面。通過顯微鑒別，可將表皮類皮孔樣突起、分枝星狀毛以及多細胞棒狀毛作為紫錐菊的專屬鑒別特征。菊苣酸可作為紫錐菊薄層色譜鑒別的指標成分。另有通過性狀鑒別初步鑒定了紫錐菊與狹葉紫錐菊，但未進行微細結構上的微性狀鑒別描述[19]。今后可通過微性狀、顯微及理化鑒別開展紫錐菊及其變種的鑒別研究。