HPLC法同時測定木香順氣丸中6種成分

李靜華， 王麗瓊

(1.樂山職業技術學院，四川 樂山 614000；2.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000；3.四川省藥品監督管理局中藥質量研究重點實驗室，四川 樂山 614000)

木香順氣丸功效行氣化濕、健脾和胃，方中厚樸、枳殼、陳皮、青皮為臣藥，甘草為使藥[1]，其中甘草指標成分為甘草苷，健脾益氣，補中除濕[2-3]；陳皮、青皮、枳實指標成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷[4-6]，行氣燥濕，散結消積；厚樸指標成分為和厚樸酚、厚樸酚[7-8]，行氣燥濕，散結消積。該制劑收載于2020年版《中國藥典》一部，但只測定了和厚樸酚、厚樸酚含量[9]，而中藥質量和療效提倡整體性，故多組分同時測定可更全面地體現其質量[10-12]。

前期孫全明[13]、曹瑞竹[14]等采用HPLC法測定木香順氣丸中木香烴內酯、去氫木香烴內酯、厚樸酚、和厚樸酚、甘草酸含量，王玲嬌等[15]采用光譜指紋法評價木香順氣丸質量，但尚無同時測定甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚含量的報道。因此，本實驗建立HPLC法同時測定該制劑中上述6種成分的含量，以期為整體全面地控制其質量提供可靠科學的依據。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；XS205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ULUP-II-10T優普系列超純水器(成都超純科技有限公司)。

厚樸酚(批號110729-201513，純度98.8%)、和厚樸酚(批號110730-201614，純度99.3%)、新橙皮苷(批號111857-201804，純度99.4%)、橙皮苷(批號110721-201818，純度96.2%)、柚皮苷(批號110722-201613，純度94.3%)、甘草苷(批號111610-201607，純度93.1%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。木香順氣丸(甘肅佛仁制藥科技有限公司，批號200401；山西萬輝制藥有限公司，批號191101；甘肅河西制藥有限責任公司，批號200901)，規格均為每袋6 g。乙腈、甲醇為色譜純(北京百靈威科技有限公司)；N-N二甲基甲酰胺為分析純(成都市科隆化學品有限公司)；磷酸為分析純[重慶川東化工(集團)有限公司]；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取對照品厚樸酚24.78 mg、和厚樸酚14.19 mg、新橙皮苷17.50 mg、橙皮苷120.62 mg、柚皮苷27.61 mg、甘草苷11.04 mg，分別置于6個25 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取5、5、10、10、10、2 mL，置于同一50 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，精密量取5 mL，置于10 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 將本品粉碎，取約1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入N-N二甲基甲酰胺50 mL，稱定質量，超聲處理1 h，放冷，N-N二甲基甲酰胺補足減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方制得不含陳皮、青皮、枳殼、甘草、厚樸的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 SVEA C18Opal色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸(A)-乙腈(B)-甲醇(C)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長276 nm；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.3 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在”2.2”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖中各成分保留時間與對照品溶液色譜圖中一致，并且分離度符合要求，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下貯備液8、6、4、2、1 mL，分別置于5個10 mL量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，再以S/N=10計算定量限，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.5 精密度試驗 取“2.1.1”項下對照品溶液適量，在“2.2”項色譜條件下進樣測定6次，測得厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷峰面積RSD分別為0.4%，0.3%，0.7%，0.8%，1.1%、0.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批本品(批號200401)，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷含量RSD分別為1.2%，1.3%，1.6%，1.6%，1.9%、1.9%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號200401)適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷峰面積RSD分別為0.9%、0.9%、1.2%、1.3%、1.4%、1.1%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品(批號200401，厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷含量分別為2.089 2、0.752 7、1.443 7、20.935 5、1.935 4、0.148 5 mg/g)6份，每份約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入 “2.1.1”項下0.2 mL甘草苷貯備液、1 mL柚皮苷貯備液、2 mL橙皮苷貯備液、1 mL新橙皮苷貯備液、0.7 mL和厚樸酚貯備液、1 mL厚樸酚貯備液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液各6份，在“2.2”項色譜條件下各進樣10 μL測定，計算回收率。結果，厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷平均加樣回收率分別為101.0% (RSD=2.0%)、100.7% (RSD=1.5%)、100.1% (RSD =1.4%)、99.8% (RSD =1.7%)、100.6% (RSD =1.9%)、99.1%(RSD=1.9%)。

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行3份，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 檢測波長選擇 本實驗發現，甘草苷在276 nm波長處有吸收峰，而且吸收強度較大，同時厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷在該處的吸收強度也較好。最終確定，檢測波長為276 nm。

3.2 流動相選擇 本實驗比較了乙腈、甲醇對各成分分離效果的影響，發現采用乙腈時色譜峰保留時間提前，峰形尖銳，并且加入一定比例甲醇后保留時間適中，分離度良好。由于各成分理化性質不一致，故前10 min進行大比例水相等度洗脫，10～17 min進行梯度洗脫，可將柚皮苷、橙皮苷與相鄰雜質峰的分離度提高到3.0左右，從而排除干擾峰的影響。

3.3 提取溶劑選擇 本實驗比較了50%甲醇、2%醋酸甲醇、甲醇、N-N二甲基甲酰胺、甲醇-(N-N二甲基甲酰胺)混合溶液(比例分別為45∶5、40∶10、30∶20、20∶30、10∶40、5∶45)對各成分提取能力的影響，發現甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷提取率受溶劑種類的影響較大，尤其是含量較高的橙皮苷；以N-N二甲基甲酰胺提取時，各成分溶解性較好，提取完全。最終確定，提取溶劑為N-N二甲基甲酰胺。

4 結論

本實驗采用HPLC法同時測定木香順氣丸中厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷的含量，該方法操作簡單，方法學考察結果良好，可為整體全面地控制該制劑質量提供可靠科學的依據。