乙酰氨基阿維菌素合成工藝探究

陳東

（寧夏泰益欣生物科技有限公司，寧夏銀川 750205）

乙酰氨基阿維菌素是以阿維菌素為原料藥進行合成的一種高效、廣譜、低殘留的獸用驅蟲藥物，此種藥品是美國食品藥品監督管理局（FDA）和歐盟批準的唯一應用于泌乳奶牛不需棄奶的廣譜驅蟲藥，由默克公司于1997年開發，是第1個可以應用于奶牛和肉牛，而不需要休藥期的廣譜抗寄生蟲藥，其制劑已在多個國家批準上市[1]。

乙酰氨基阿維菌素是一種16元的大環內酯類抗生素，其基本結構是碳16位上的大酯環和3個主要取代基團，即C-2到C-8位上的六氫苯丙呋喃類，C-13位上的雙糖基，C-17到C-18位上的螺酮縮醇基團。乙酰氨基阿維菌素由2種主要成分組成，B1a和B1b（B1a＞90%，B1b＜10%）[2]，如圖1所示。

藥代動力學研究結果表明，乙酰氨基阿維菌素可以經多種途徑吸收，如口服、皮膚接觸、皮下或肌肉注射，藥效均較好，可迅速分布到全身。但迄今為止，乙酰氨基阿維菌素商品化的制劑只有澆潑劑和注射劑兩種[3]。其中，澆潑劑應用于烈性動物比較方便，而注射劑雖然生物利用率較高，但注射部位疼痛明顯，對動物的驚擾較大。研究發現，對吸血或吸食體液的線蟲和節肢動物的預防效果而言，口服的吸收效果優于透皮吸收。同時，與注射相比，口服給藥可以縮短藥劑代謝后在糞便中的半衰期，并降低藥劑濃度而減輕對環境的毒性[4]，而且口服藥劑投藥簡單、劑量易掌握、準確率高，較適合單胃動物使用。乙酰氨基阿維菌素目前已廣泛運用于畜類寄生蟲的防治，作為最新一代的獸用驅蟲藥物，主要用于放置畜類（特別是產乳期）的寄生蟲、虱、螨、蠅等各種內外寄生蟲，由于其對家畜體內外各種寄生蟲的極高活性，以及在乳品中極低的分配系數，使其成為第一個可用于各種家畜任何生長期的殺蟲劑，應用于奶牛和肉牛時無需休藥期。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YP4002電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；waters 2487型HPLC（江蘇塞恩斯科技有限公司）；HK-3C型酸度計廠家為北京海富達科技有限公司，HS-DHG電熱恒溫鼓風干燥箱（上海和晟儀器科技有限公司）；pH計；溫度計。

1.2 試劑

七甲基二硅氮烷，三氟乙酸鋅，硼氫化鈉，醋酸銨，碳酸鈉，碳酸氫鈉，純化水。

2 材料與方法

2.1 材料來源

本試驗所用阿維菌素由寧夏泰益欣生物科技有限公司提供。

2.2 方法

收率=目的產物（實際）生成量/目的產物的理論生成量＊100%或生成目產物的原料量/原料進料量＊100%。

采用單因素分析方法探究各因素對乙酰氨基阿維菌素收率及含量的影響，并建立了HPLC法測定乙酰氨基阿維菌素的含量。色譜條件:WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×250mm, 5μm)；流動相為水-乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-四氫呋喃(805∶115∶25∶55) ;流速1.0 mL/min，波長為280nm。

3 結果與分析

3.1 氨化反應投料比例的優化

氨化反應過程中投入阿維菌素保護液，再投入七甲基二硅氮烷和三氟乙酸鋅，對阿維菌素保護液進行氨化。在此過程中，七甲基二硅氮烷和三氟乙酸鋅的投料量對氨化結果具有重要的影響，若投料過多，會導致產品的收率和含量下降，同時也會造成原料的浪費；若投料量過少，則會導致氨化不完全，也會造成乙酰氨基阿維菌素收率和含量的降低。采用下表的比例進行投料，計算乙酰氨基阿維菌素收率和含量。具體實驗結果見表1和圖2：

表1 氨化反應投料比例對收率和含量的影響

由表1和圖2可知，七甲基二硅氮烷與阿維菌素保護液具有一個適當的投料比例，隨著七甲基二硅氮烷與阿維菌素保護液的投料比例增大，乙酰氨基阿維菌素的含量和收率均隨著比例的增加呈先上升后下降的趨勢，結果顯示：七甲基二硅氮烷與阿維菌素保護液的最適比例為5:1，此種比例下乙酰氨基阿維菌素的含量和收率均較高。

3.2 氨化反應溫度的優化

采用七甲基二硅氮烷與阿維菌素保護液比例為5:1的條件下，研究不同溫度條件對乙酰氨基阿維菌素的收率和含量的影響，反應溫度設置5個梯度，分別為50、55、60、65和70℃。反應時間控制在200min。具體結果見表2和圖3：

由表2和圖3可知，共設5個溫度梯度，隨著溫度的上升，乙酰氨基阿維菌素的含量和收率為呈現出規律性的變化，其中含量和收率均在反應溫度達到60℃時達到了最大值，分別達到了66.9%和91.8%。整體來看，隨著溫度的變化，收率呈現相對較為平穩的趨勢，表明反應溫度對乙酰氨基阿維菌素的收率影響較小，而乙酰氨基阿維菌素的含量隨著反應溫度的變化波動較大，溫度的精細化控制有利于提升乙酰氨基阿維菌素的含量。

表2 氨化反應溫度對乙酰氨基阿維菌素收率和含量的影響

3.3 還原劑種類的優化

取阿維菌素氨化液進行還原，還原劑分別以硼氫化鈉、醋酸銨、碳酸氫鈉和碳酸鈉等進行實驗，還原性試劑一般采用弱酸強堿鹽，但氨化液的還原效果取決于還原劑的種類。在阿維菌素氨化液還原過程中加入一種或幾種溶液的混合，有助于促進阿維菌素氨化液的還原，提高產品收率和含量，其結果根據還原液的澄清度進行確定最適還原劑。具體結果見表3：

表3 還原劑種類的優化

實驗結果表明，以上4種還原劑均可用于阿維菌素氨化液的還原，但對阿維菌素氨化液的還原程度有一定的影響，由上表中可以看出，4種還原劑對還原程度的影響表現在溶液的澄清度影響如下，溶液澄清度順序為硼氫化鈉＞醋酸銨＞碳酸氫鈉＞碳酸鈉。在阿維菌素氨化液還原過程中，溶液越澄清表明還原反應進行的越徹底，獲得的乙酰氨基阿維菌素的收率和含量越高。

3.4 脫保護反應pH的優化

脫保護反應所用阿維菌素還原液，加入催化劑和無水乙醇后，會對還原液的pH產生較大的影響，因此采用乙酸溶液和5mol/L的氫氧化鈉溶液進行調節還原液脫保護后的脫保護液的終止反應pH，此部分確定脫保護反應進行的最適pH，使得脫保護反應達到最大程度。具體實驗數據見表4和圖4：

表4 脫保護反應pH對乙酰氨基阿維菌素收率和含量的影響

由表4和圖4結果可知，脫保護反應溶液的pH對乙酰氨基阿維菌素的含量和收率具有一定的影響，結果顯示隨著pH的上升，乙酰氨基阿維菌素的含量和收率呈現出先上升后下降的趨勢，當溶液的pH為6.0時，乙酰氨基阿維菌素的收率和含量均偏高，分別為92.0%和68.1%。

3.5 正交試驗

在優選出來各單因素最佳結果的基礎上，確定每個因素的考察范圍，采用正交試驗法選出最優組合。以氨化反應投料比例（因素A）、氨化反應溫度(因素B)、還原劑種類(因素C)、脫保護反應pH(因素D)為考察因素，每因素取3水平，選用L9(34)正交表進行試驗，考察各因素對結晶收率的影響，優選最佳結晶工藝。因素水平表見表5，實驗結果見表6：

表5 乙酰氨基阿維菌素合成工藝的因素表

表6 乙酰氨基阿維菌素合成工藝條件的正交試驗結果

極差分析結果表明，A、B、C、D 4個因素對乙酰氨基阿維菌素收率的影響程度順序為氨化反應投料比例＞還原劑種類＞氨化反應溫度＞脫保護反應pH，各因素最佳組合為A3B1C3D2，即氨化反應投料比例為5.0:1；還原劑種類為硼氫化鈉；氨化反應的溫度為70℃；脫保護反應的pH為6.0。

3.6 工藝穩定性驗證

按照最佳工藝進行了5次平行試驗，試驗結果見表7。

表7 工藝穩定性驗證結果

由實驗結果可知，5次平行試驗得到的乙酰氨基阿維菌素平均收率在91.46%以上，含量提高至67.1%。且平行試驗的相對標準偏差分別為0.08%和0.089%，表明該工藝合理可行。

4 結論

本研究為了提升乙酰氨基阿維菌素的收率和含量，在現有工藝條件的基礎上進行調節，分別考察了氨化反應投料比例、還原劑種類、氨化反應溫度及脫保護反應的pH等條件對乙酰氨基阿維菌素收率和含量的影響，其結果顯示氨化反應投料比例為5:1；氨化反應的溫度為70℃；還原劑種類為硼氫化鈉；脫保護反應的pH為6.0為最優工藝組合，最終經過5次平行實驗驗證此最優工藝的穩定性，生產所得的乙酰氨基阿維菌素收率和含量均較為穩定，相對標準偏差均在正常范圍內，詳細參數可根據實際生產情況進一步優化。