基于莧菜轉錄組的TCP基因家族成員鑒定及表達分析

安子賢，李宜軒，鄭友峰，肖 昉，王 樂，陳 何，賴鐘雄，牟建梅，劉生財*

（1.福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.蘇州市農業科學院，江蘇 蘇州 215000）

0 引言

【研究意義】莧菜（Amaranthus tricolorL.）屬石竹目莧科莧屬富含甜菜色素的一年生雙子葉草本植物[1-3]，環境條件對莧菜的營養品質和產量具有重要影響。因此，探究非生物脅迫對莧菜產量及品質的影響具有重要意義。【前人研究進展】TCP是植物特有的一類轉錄因子，由TB1（TEOSINTE BRANCHED1）、CYC（CYCLOIDEA）和PCFs（PCF1、PCF2）3個成員組成，含有59個氨基酸，其主要特征在于其N端含有一個高度保守的bHLH結構域，該結構域又稱為TCP結構域[4]。在模式植物擬南芥中，TCP基因主要對花、芽和葉片的生長發育起到調控作用，參與信號轉導，對細胞有一定的調控作用，同時響應多種非生物脅迫應答反應。研究發現，多數柳枝稷TCP基因對鹽脅迫有響應，并且在鹽脅迫條件下表現出不同的表達譜[5]；在菜豆研究中發現， TCP 基因與鹽脅迫相關[6]；李佳皓等[7]研究證實馬鈴薯TCP對鹽脅迫下馬鈴薯的生長發育有一定的調控作用。TCP基因與miR319二者對甘藍型油菜鹽脅迫均有響應，TCP靶基因的表達受到miR319的控制進而調控植株的耐鹽性[8]；TCP參與植物器官的形態發育及細胞分裂的調控等[9-10]；任麗[11]對白樺TCP基因的研究證實了BpTCP3在白樺的不同部位均有表達，尤其在根部表達量最為顯著。【本研究切入點】TCP在陸地植物、藻類植物和苔蘚植物當中均有發現，并且對于植物中TCP基因的研究非常廣泛[12]。目前，在擬南芥[13]、馬鈴薯[14]、茄子[15]、水稻[16]、高粱[9]和玉米[17]等園藝植物中對TCP在其物種中的作用和功能均有研究。但TCP基因在莧菜中的表達情況及功能尚不明確。【擬解決的關鍵問題】對莧菜TCP基因家族進行篩選鑒定，探討不同條件下TCP基因表達情況，為探究該家族基因在非生物脅迫條件下對莧菜產量和品質的影響奠定基礎，為調控莧菜生長發育過程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

莧菜種子為蘇莧1號，由蘇州市農業科學院提供。采用紙床法，將種子播種在培養皿中，分別進行NaCl鹽脅迫（0、50、100 、200 mmol·L-1）、不同銨硝比（二者濃度為0∶0、0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0），分 別 用 NCK、 N1、 N2、 N3、 N4、 N5表 示 ）[18]及黑暗和藍光培養，培養溫度（25 ±2） ℃，除黑暗條件下培養外，其他處理光照時間為16 h/8 h（光/暗）。培養5 d后取整株莧菜進行RNA提取用于后續試驗。莧菜不同組織部位采用30 d盆栽苗，分別取根、莖、葉進行RNA提取用于qRT-PCR分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 數據來源及AtrTCP家族基因的鑒定 數據來源于大紅莧菜胚軸的轉錄組數據庫（登錄號SRA：SRR5930345），該數據庫由本實驗室課題組獲得，基因篩選方法參考王樂等[19]基因鑒定方法，通過Nr、Nt、Swissprot和Pfam 4個數據庫篩選基因，在篩選時輸入“TCP”進行篩選，得到初篩基因，并利用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對初篩基因進行篩選及鑒定。

1.2.2AtrTCP基因家族蛋白生物信息學分析及保守結構域分析 利用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、Plant-mPLoc Server（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）和 MEME Suite 5.1.0（http://meme-suite.org/tools/meme）等在線軟件對AtrTCP蛋白序列的理化性質、蛋白質二級結構、亞細胞定位和保守基序進行分析；利用TBtools、MEGA-X、DNAMAN生物信息學分析軟件構建系統進化樹；利用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）在線軟件對miRNA進行預測。具體分析方法參照王樂等[19]方法進行基因家族分析。

1.2.3 不同條件處理莧菜幼苗及qRT-PCR分析 通過紙床法對莧菜幼苗在鹽脅迫、硝銨配比及黑暗和藍光下進行處理，在培養皿中放置3層濾紙，分別加入5 mL處理液，以ddH2O為對照組，除黑暗和藍光處理外，其余處理均放在16 h/8 h（光/暗）培養室中進行培養；莧菜放在黑暗和藍光下進行處理，處理5 d后進行取樣。使用天漠科技開發有限公司（北京）提供的總RNA提取試劑盒提取不同濃度鹽脅迫、硝銨配比以及黑暗、藍光處理條件下的莧菜總RNA，經過逆轉錄得到cDNA模板，利用DNAMAN軟件進行引物設計，該基因組定量引物及內參引物（EF1a）設計見表1，該引物由鉑尚生物技術有限公司（福州）合成。qRT-PCR結果分析根據2-ΔΔCt法計算基因表達量。

表1 AtrTCP定量引物Table 1 Quantitative primers of AtrTCP

2 結果與分析

2.1 莧菜TCP基因家族的鑒定

基于莧菜轉錄組數據，通過SMART篩選以及NCBI比對后，最終得到14個TCP家族成員基因，依次命名為AtrTCP1~AtrTCP14（表2）。通過對TCP基因家族成員進行理化性質分析，結果顯示AtrTCP蛋白質長度在230~721 aa，相對分子量為25.25~78.57 kD，等電點為6.15~9.45；AtrTCP11為穩定蛋白外，其余均為不穩定蛋白；AtrTCP蛋白全部為親水蛋白（表2）。在對其蛋白質二級結構分析時發現，無規卷曲比例最高，處于54.91%~71.63%；其次是α-螺旋，為 11.82%~24.23%；延伸鏈為 10.23%~21.33%；β-轉角比例最低，為1.69%~10.95%；對該基因家族亞細胞定位發現全部定位于細胞核中 （表3）。

表2 AtrTCP基因家族理化性質分析Table 2 Physicochemical properties of AtrTCP family

表3 AtrTCP基因家族蛋白質二級結構及亞細胞定位分析Table 3 Protein secondary structures and subcellular localizations of AtrTCP family

2.2 莧菜AtrTCP家族系統進化樹分析

根據TCP基因家族進化關系，將TCP基因家族劃分為2個亞族：Class I和Class II；Class I為PCF，而Class II劃分2個分支CYC/TB1和CIN。通過MEGA-X軟件，對篩選得到的14個AtrTCP基因家族成員進行基因家族進化樹的構建，根據莧菜AtrTCP基因與模式植物擬南芥AtTCP基因聚類分析發現，Class I亞族中，含有22個TCP家族成員，其中擬南芥12個，莧菜10個；Class II亞族中，CIN分支含有12個TCP家族成員，其中擬南芥8個，莧菜4個；CYC/TB1分支含有4個TCP家族成員，全部為擬南芥。AtrTCP1與AtTCP20、AtrTCP4與AtTCP2、AtrTCP8與AtTCP19、AtrTCP10與AtTCP11和AtrTCP12與AtTCP13基因親緣關系較近（圖1)，表明這5個莧菜AtrTCP基因與擬南芥AtTCP基因具有相似功能。

2.3 莧菜AtrTCP蛋白保守基序分析

通過MEME對AtrTCP蛋白進行保守基序分析，共獲得了15個保守基序，依次命名為Motif1~Motif15。所有AtrTCP都含有Motif1基序，Motif1高度保守；除AtrTCP2、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP12外，其余AtrTCP均含有Motif2基序，Motif5出現6次，Motif12出現5次，其余蛋白保守基序均少于5次（圖2）。結合聚類分析發現，PCF（Class I）亞族成員包含特有的Motif2基序；CIN（Class II）亞族成員均含有Motif3基序（圖1、2）。

2.4 調控莧菜AtrTCP的miRNA預測

通過psRNATarget在線軟件，以莧菜small RNA數據庫為參考，AtrTCP核苷酸序列為待測序列，將篩選得到的14個AtrTCP家族成員進行miRNA預測，結果顯示，只有4個AtrTCP家族成員受到miRNA的調控，AtrTCP6和AtrTCP2受到miR319_1、miR319_2、miR319a-3p和 miR319a_1的調控；AtrTCP11和AtrTCP13受到 miR5658的調控（表4）。miRNA的表達趨勢結果顯示，AtrTCP6和AtrTCP2總體表現為上調趨勢。

表4 莧菜AtrTCP基因家族miRNA的預測及差異表達分析Table 4 Prediction and differential expressions of AtrTCP family miRNA

2.5 不同處理下莧菜AtrTCP實時熒光定量PCR分析

2.5.1 鹽脅迫下莧菜AtrTCP家族成員qRT-PCR分析NaCl鹽溶液處理下的莧菜AtrTCP基因家族各成員qRT-PCR結果顯示，AtrTCP2在50 mmol·L-1的處理下表達量最高，隨著濃度升高，該基因表達量呈下調趨勢；AtrTCP6、AtrTCP11和AtrTCP12的表達量隨著鹽溶液濃度的升高呈上調趨勢，在100 mmol·L-1的處理下表達量達到最高值，而后呈下調趨勢；AtrTCP8、AtrTCP9和AtrTCP14的表達量隨著鹽溶液濃度的升高呈下調趨勢；AtrTCP1在200 mmol·L-1的處理下表達量達到最大值；隨著濃度的升高，AtrTCP3和AtrTCP10的表達量呈現先下調后上調的趨勢；AtrTCP7和AtrTCP13的表達量呈現上調趨勢；在不同鹽濃度處理下AtrTCP5的表達量無明顯變化（圖3）。

2.5.2 光質處理下莧菜AtrTCP基因家族qRT-PCR分析 藍光和黑暗處理下的莧菜AtrTCP基因家族qRT-PCR分析結果顯示，AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10在藍光條件下表達呈上調趨勢，其余成員的表達均呈下調趨勢，其中，AtrTCP10基因在藍光條件下，表達量顯著上調；AtrTCP2、AtrTCP3、AtrTCP8、AtrTCP9、AtrTCP11和AtrTCP13表達量下調達到了顯著水平（圖4）。

2.5.3 不同銨硝比處理下莧菜AtrTCP基因家族成員qRT-PCR分析 不同銨硝比處理下的莧菜AtrTCP基因家族成員qRT-PCR結果顯示，AtrTCP2、AtrTCP3、AtrTCP9和AtrTCP10在銨硝比為0∶10和3∶7的表達量顯著高于銨硝比為10∶0和7∶3的表達量，其中AtrTCP3在不同銨硝比處理下與NCK對照發現，各處理表達量均上調，且均與NCK有顯著差異，參與整個氮代謝；而AtrTCP1則在銨硝比為10∶0和7∶3的表達量更高；AtrTCP4、AtrTCP7、AtrTCP8、AtrTCP10、AtrTCP11、AtrTCP12、AtrTCP13和AtrTCP14在不同銨硝比處理下表達量均下調；AtrTCP5隨著銨態氮配比的增大，表達量呈現先下降再上升再下降的趨勢，其中，在銨硝比為0∶0的處理下表達量最高，但在0∶10、3∶7、7∶3 和 10∶0 處理下無顯著差異（圖5）。

2.5.4 莧菜不同組織部位qRT-PCR分析 通過對莧菜不同部位的TCP家族成員進行qRT-PCR分析，結果顯示，AtrTCP家族成員AtrTCP3、AtrTCP12在葉部的表達量較高，其余家族成員均在根部的表達量較高（圖6）。

3 討論與結論

TCP轉錄因子在N段端有著高度保守的結構域，是植物特有的一類轉錄因子。植物的轉錄因子數量差異也很大，研究發現，多數植物中存在TCP基因，玉米52個[20]、小麥28個[21]、水稻27個[16]、高粱27個[9]、棉花73個[22]、谷子26個[23]、擬南芥24個[24]和牡丹18個[25]等，而在莧菜中鑒定出14個成員，少于已報道的物種，這說明植物TCP轉錄因子數量在不同物種間差異比較大，這種現象產生的原因可能是由于莧菜TCP基因來源于轉錄組數據庫，部分基因沒有表達，而其他物種均來源于全基因組數據庫。

在對不同物種進行生物信息學分析時發現，不同物種中聚類關系越緊密，說明兩者很大可能上具有相似的功能，在進化樹中發現，AtrTCP1與AtTCP20、AtrTCP4與AtTCP2、AtrTCP8與AtTCP19、AtrTCP10與AtTCP11和AtrTCP12與AtTCP13等5對可能具有相似的功能，其中，AtrTCP1可能與AtTCP20功能相似，參與調控細胞擴增、細胞分裂及細胞分化等[26]；AtrTCP4可能與AtTCP2功能相似，在調控植物葉片形態和大小上發揮著重要作用[27]；AtrTCP8可能與AtTCP19功能相似，參與植物防御[28]；AtrTCP10與AtTCP11具有相似的功能，在調控維管束的發育方面發揮著重要的作用[29]；AtrTCP12可能在調控細胞分裂素信號途徑應答方面發揮作用[30]。microRNA（miRNA）作為一種調控植物生長發育以及響應脅迫的內源性小RNA分子存在[31]。miRNA預測發現，AtrTCP基因家族大多均受到miR319的調控，這與芥菜[32]、蝴蝶蘭[33]等多種植物相同，miRNA319對植物TCP基因家族的調控具有重要作用，并且已經證實miR319靶向TCP基因[5]，而miRNA和TCP基因家族主要參與葉片的生長發育，對葉片有多層次的調控[34]。本研究發現AtrTCP2和AtrTCP6受多種miRNA調控，主要為miR319。有研究表明，藍光對于甜菜色素的合成有促進作用[35]，莧菜AtrTCP基因家族成員AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10在藍光條件下表達量上調，推測AtrTCP1、AtrTCP4、AtrTCP6和AtrTCP10促進莧菜中甜菜色素的合成，但是TCP轉錄因子參與甜菜色素的合成機制有待進一步研究。

對莧菜的不同部位qPCR結果分析發現，AtrTCP基因家族中的不同成員對莧菜不同組織部位具有不同表達模式，各成員在根部的表達量均較高，說明TCP直接作用到根部，進而影響整株植物的生長發育。而在莖部中，AtrTCP5表達量最高，其次是AtrTCP3，研究表明，芥菜中ClassⅠ亞族成員在莖的發育過程中發揮著重要作用[32]。AtrTCP12在葉部的表達量最高，AtrTCP2、AtrTCP3和AtrTCP4在葉部也具有較高的表達趨勢，這也進一步印證不同物種中親緣關系較近的植株之間存在相似的功能，TCP基因家族中部分成員在調控植物葉片生長發育過程中發揮著重要作用。

對鹽脅迫下莧菜TCP基因定量結果分析發現，高濃度的鹽脅迫對莧菜的生長發育有明顯的抑制作用，高濃度下植物改變體內通路；而低濃度的鹽脅迫對莧菜的生長發育的抑制作用較弱，低濃度下植物體內自身防御系統起作用，而王廷芹等[36]對莧菜幼苗和曾泳怡等[37]對水稻幼苗等對生理研究結果相一致。AtrTCP基因在不同光質、不同硝銨配比處理中發現，AtrTCP對光、非生物脅迫等有不同程度的響應，這與谷子等[23]植物鹽脅迫相關研究結果相一致。研究結果為進一步探究TCP基因家族提供依據，并為TCP基因在莧菜生長過程中的作用機制及對莧菜非生物脅迫及發育的影響提供參考。