不同施氮水平下AM真菌對(duì)高粱生物量及氮磷吸收的交互效應(yīng)

王 健，張海歐，楊晨曦，李 娟*

（1.自然資源部退化及未利用土地整治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710075；2.陜西地建土地工程技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，陜西 西安 710075）

0 引言

【研究意義】自20世紀(jì)中葉以來，化石燃料的大量燃燒、化肥的過量使用以及過度放牧等人類活動(dòng)導(dǎo)致大氣中的活性氮氧化物含量激增，大氣氮素沉降也呈迅猛增加的趨勢(shì)[1]。有研究表明，2010年我國(guó)華北平原部分經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)氮沉降速率已接近30 kg·hm-2·a-1[2]。人為干擾下的大氣氮素沉降已成為全球氮素生物化學(xué)循環(huán)的一個(gè)重要組成部分，大氣氮沉降速率的急劇增加將嚴(yán)重影響生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和穩(wěn)定性[3]。由于自然生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和生物多樣性對(duì)外源氮的敏感性，氮沉降對(duì)植物的影響受到越來越多學(xué)者的關(guān)注[4-6]。叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是土壤里廣泛分布的一類有益微生物，能與絕大多數(shù)的陸生植物形成菌根互惠共生體[7]。AM真菌通過其密集的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)幫助宿主植物汲取土壤中的水分和無機(jī)營(yíng)養(yǎng)，換取宿主植物光合作用產(chǎn)物用于自身的生長(zhǎng)繁殖。預(yù)測(cè)大氣氮沉降速率增加的背景下，研究AM真菌對(duì)作物，尤其是對(duì)莊稼作物的影響，對(duì)于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的施肥管理具有重要的理論和實(shí)踐意義。【前人研究進(jìn)展】研究表明，AM真菌能顯著提高宿主植物對(duì)氮、磷的吸收，進(jìn)而提高其生物量[8]。此外，氮沉降引起的土壤氮含量增加會(huì)直接影響AM真菌的多樣性和功能，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)[9]。Johnson等[10]發(fā)現(xiàn)在氮受限制的土壤環(huán)境下，氮含量的增加有利于菌根與植物形成共生，而Jiang等[11]的研究結(jié)果則表明在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中隨著氮含量的增加，AM真菌與植物的關(guān)系逐漸由共生變?yōu)榱思纳Ｓ纱丝梢姡珹M真菌在不同氮環(huán)境下或不同生態(tài)系統(tǒng)中，形成菌根的能力不同，對(duì)植物生長(zhǎng)效應(yīng)也不同。張旭紅等[12]研究證明，AM真菌對(duì)宿主植物的有效性決定了他們之間的相互選擇性。【本研究切入點(diǎn)】先前關(guān)于不同施氮背景下的宿主植物對(duì)AM真菌的響應(yīng)研究主要集中于高寒草甸或干旱半干旱性草原，且供試宿主也多以草本植物為主。一年生草本植物高粱（Sorghum hicolorL.Mocrnch）是關(guān)中平原地區(qū)常見的糧食作物，又因其侵染率高、生物量大、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)速度快，常被作為AM真菌功能研究的模式宿主之一。當(dāng)前我國(guó)關(guān)中平原地區(qū)高粱復(fù)種指數(shù)高、氮肥施用量大且利用效率低。關(guān)中平原地區(qū)高粱氮肥減施增效技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)用對(duì)我國(guó)粗糧生產(chǎn)具有典型性和引領(lǐng)性。【擬解決的關(guān)鍵問題】以高粱為研究對(duì)象，通過溫室盆栽模擬試驗(yàn)探究AM真菌和氮添加對(duì)高粱生物量及氮磷吸收的影響，旨在為全球氣候變化背景下AM真菌生理生態(tài)學(xué)的研究提供一定的科學(xué)依據(jù)，為我國(guó)高粱的高產(chǎn)種植以及微生物肥料的制備提供實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種為摩西球囊霉（Glomus mosseae），以高粱為宿主植物擴(kuò)繁得到，每克菌劑含有110個(gè)孢子，包括植物根斷、菌絲等。菌種來自蘭州大學(xué)細(xì)胞活動(dòng)與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。供試高粱品種為京雜抗四雜交高粱（Sorghum hicolorL.Mocrnch），來自陜西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。供試盆栽基質(zhì)為河沙與沸石混合物[V（河沙）∶V（沸石）=1∶1]，沸石和河沙購(gòu)自北票市天翊沸石礦業(yè)有限公司，河沙粒徑1 cm，沸石粒徑2 cm。洗凈后，混合均勻，121 °C滅活2 h，隔天再滅活1次備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)置2個(gè)接種處理和4個(gè)施氮處理。2個(gè)接種處理為接種AM真菌菌劑（+AMF）和接種滅活A(yù)M菌劑（-AMF）；4個(gè)施氮水平（以NH4NO3形式添加）分別為0、200、400、500 mg·kg-1，相當(dāng)于 0、10、20、30 kg·hm-2·a-1氮沉降水平，分別用N0、N1、N2和N3表示；試驗(yàn)共8個(gè)處理，每個(gè)處理6盆，總計(jì)48盆。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2020年5月15日至9月15日在陜西地建土地工程技術(shù)研究院溫室內(nèi)進(jìn)行。高粱種子用10%的NaClO表面消毒后，于無菌沙中催芽。待種子出芽后，移苗于培養(yǎng)盆（直徑37.5 cm×高度34.5 cm）內(nèi)（基質(zhì)約10 kg·盆-1），施以hoagland營(yíng)養(yǎng)液維持植物正常生長(zhǎng)，每?jī)芍芤淮危淮?00 mL。2周后，每盆定苗5株幼苗，并在+AMF處理組幼苗根系穴施AM菌劑15 g·盆-1，在-AMF處理組幼苗根系穴施滅活A(yù)M菌劑15 g·盆-1。將定量的NH4NO3溶于水中，分別于第4周、第6周、第8周以及第12周加入不同施氮處理盆中。溫室光強(qiáng)為120 μmol·m-2·s-1，晝夜交替時(shí)間為15 h/9 h，晝夜交替溫差為23 ℃/16 ℃，生長(zhǎng)周期為4個(gè)月，每隔一周隨機(jī)移動(dòng)花盆的位置[13]。待植物生活史完成后，分別收集植物地上莖葉和地下根系，取部分鮮細(xì)根系用于侵染率的測(cè)定，剩余樣品用于生物量的測(cè)定，烘干的植物組織粉碎后用于氮磷含量測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)方法

1.4.1 菌根侵染率 取鮮根樣1 g左右裝入試管中，加入10% KOH溶液沒過根樣，于水浴鍋（70～80 ℃）中堿化處理15~30 min，自來水沖洗3遍；加入2%HCL溶液沒過根樣于水浴鍋中酸化處理30 min，自來水沖洗3遍；加入0.05% 臺(tái)盼藍(lán)[V（乳酸）∶V（甘油）∶V（水 ）=1∶1∶1]染 色 10 min， 自 來 水 洗 3遍 ；染色后的根樣剪成1 cm左右的根斷，均勻地鋪在涂有PVLG的載玻片上，蓋上蓋玻片，小心壓片至皮層被壓開。制備好的裝片置于顯微鏡下（200×）觀察并計(jì)數(shù)[14]。

式中，A為每個(gè)樣品中觀察到的有叢枝結(jié)構(gòu)的視野數(shù)；V為每個(gè)樣品中觀察到的有泡囊結(jié)構(gòu)的視野數(shù)；N為每個(gè)樣品中沒觀察到任何菌根侵染的視野數(shù)；T為每個(gè)樣品中觀察的總視野數(shù)。

1.4.2 生物量及氮磷含量測(cè)定 將高粱收獲后的地上部分、洗凈后的地下部分分別裝信封后，于恒溫干燥箱（60 ℃）中烘干48 h至恒重，稱其生物量。烘干后的植物組織經(jīng)球磨儀粉碎，過100目篩，制成供試樣品。取0.2 g供試樣品，精準(zhǔn)置于消煮管底部，加 1 g催化劑 [m（K2SO4）∶m（CuSO4）∶m（硒粉） = 100∶10∶1]，加入 5 mL濃硫酸靜置碳化 30 min，于消煮爐420 ℃消煮約40 min，直至消煮液呈現(xiàn)透明的青綠色。待冷卻后，將消煮液轉(zhuǎn)移到容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水定容至50 mL，用流動(dòng)注射分析儀測(cè)定植物組織氮磷含量（QuikChem 8500）[15]。

1.5 菌根效應(yīng)計(jì)算

計(jì)算菌根生長(zhǎng)效應(yīng)（Mycorrhizal growth response,MGR）、菌根氮吸收效應(yīng)（Mycorrhizal N-uptake response, MNR）和菌根磷吸收效應(yīng)（Mycorrhizal P-uptake response，MPR），評(píng)估不同氮梯度下AM真菌對(duì)植物的影響作用[16]，下面用MGR為例來進(jìn)行說明。

其中，NMmean代表每一個(gè)氮水平下-AMF處理組高粱生物量的平均值，AM代表每一個(gè)氮水平下+AMF處理組高粱的總生物量。同樣地，MNR和MPR也按公式（4）來計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，原始數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布后進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析，由R語言（R version 3.3.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。施氮和接種AM真菌處理對(duì)侵染率變量、植物生物量以及植物組織氮磷含量的影響利用雙因素方差分析進(jìn)行分析。采用Duncan多重檢驗(yàn)比較不同處理下各因變量之間的差異（P≤0.05），采用T-test比較各因變量在+AMF處理和-AMF處理之間的差異（P≤0.05）。此外，利用線性回歸分析不同氮水平下菌根效應(yīng)的變化規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加及接種AM真菌對(duì)高粱菌根侵染率的影響

由表1可以看出，摩西球囊霉可與高粱宿主形成良好的共生。不接種AM真菌處理（-AMF）組的高粱根系均沒有AM真菌侵染；而接種AM真菌（+AMF）顯著促進(jìn)了高粱根系的菌根侵染率（P＜0.001）、叢枝侵染率（P＜0.001）和泡囊侵染率（P＜0.001）。此外，菌根侵染率（P＜0.001）和泡囊侵染率（P＜0.001）受氮添加影響顯著，表明在不同氮水平處理下，AM真菌對(duì)高粱的侵染能力存在明顯差異；隨著氮施肥梯度增加，菌根侵染率和泡囊侵染率隨之增加，高氮水平可以抑制AM真菌對(duì)宿主的侵染。

表1 不同處理下高粱菌根侵染狀況Table 1 AM fungi colonization on inoculated sorghum plants grown on soil with varied N deposition

2.2 氮添加及接種AM真菌對(duì)高粱生物量及根冠比的影響

由圖1可以看出，施氮顯著促進(jìn)了高粱地上生物量（P＜0.001）和總生物量（P＜0.001），降低了高粱根冠比（P＜0.001），但對(duì)地下生物量沒有顯著影響（P＞0.05）。地上生物量和總生物量隨著氮肥施用量的增加而增加，根冠比則隨著氮肥施用量的增加而降低。接種AM真菌對(duì)高梁地上生物量、地下生物量、總生物量以及根冠比在全部水平下無顯著影響（P＞0.05），表明在各個(gè)氮處理水平下接種AM真菌對(duì)高粱的生物量影響不大。在未施氮處理（N0）組，接種AM真菌顯著提高了高粱的地上生物量和總生物量（P＜0.05）；在高水平氮添加下（N3），接種AM真菌顯著抑制了高粱的地上生物量和總生物量（P＜0.05）；在N2和N3處理下，接種AM真菌顯著增加了高粱的根冠比（P＜0.05）。此外，由圖1可以看出，接種AM真菌和氮添加處理對(duì)高粱的地上生物量（P＜0.001）、地下生物量（P＜0.05）、總生物量（P＜0.001）以及高粱根冠比（P＜0.05）存在顯著的交互作用。

2.3 氮添加及接種AM真菌對(duì)高粱氮磷吸收的影響

雙因素方差分析結(jié)果表明施氮顯著增加了高粱植株的全氮含量（P＜0.001），接種AM真菌對(duì)高粱植物的全氮含量無顯著差異（P＞0.05），施氮和接種對(duì)高粱組織的全氮含量存在顯著交互作用（P＜0.001）。在未施氮處理組接種AM真菌顯著增加了高粱植株的全氮含量（P＜0.05），而在高水平氮添加下（N2和N3），接種AM真菌顯著降低了高粱植株的全氮含量（P＜0.05）（圖2-a）。由圖2-b可以看出，高粱組織的全磷含量（P＜0.05）受氮添加處理的影響達(dá)到了顯著水平，而受AM真菌接種的影響較弱，此外，施氮和接種AM真菌對(duì)高粱組織的全磷含量存在顯著交互作用（P＜0.001），在未施氮處理下，接種AM真菌顯著促進(jìn)了高粱植株的全磷含量（P＜0.05），而在高水平氮添加下（N3），接種AM真菌對(duì)植株全磷含量則表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P＜0.05）。施氮顯著促進(jìn)了高粱植株的氮磷比（P＜0.001），接種AM真菌對(duì)高粱植株的氮磷比在各氮水平梯度下無顯著影響（P＞0.05），但在未施肥處理組，接種AM真菌顯著提高了高粱的氮磷比；接種AM真菌和氮添加對(duì)高粱的氮磷比的影響也不存在顯著的交互作用（P＞0.05）（圖2-c）。

2.4 氮添加及接種AM真菌對(duì)高粱生長(zhǎng)的交互效應(yīng)

由圖3-a可知，施氮顯著影響了高粱的菌根生長(zhǎng)效應(yīng)，在N0和N3處理組，AM真菌對(duì)高粱植株的促生效應(yīng)MGR的影響達(dá)顯著水平（P＜0.05），菌根生長(zhǎng)效應(yīng)隨氮施肥梯度的增加而逐漸降低，呈線性關(guān)系（R2= 0.81，P＜0.001）。菌根氮吸收效應(yīng)（MNR）（R2= 0.93，P＜0.001）和菌根磷吸收效應(yīng)（MPR）（R2= 0.88，P＜0.001）和氮添加梯度呈線性關(guān)系，均隨氮添加濃度的增加而降低，且在N0、N2和N3均達(dá)到顯著水平。

3 討論與結(jié)論

菌根侵染率是AM真菌與宿主植物建立共生成功與否的重要標(biāo)志，并在一定程度上決定著宿主植物的生長(zhǎng)和抗逆能力[17]。泡囊和叢枝是AM真菌的根內(nèi)菌絲特化的結(jié)構(gòu)，其數(shù)量決定著菌根共生體內(nèi)物質(zhì)交換的頻率和強(qiáng)度[18]。菌根侵染率既受宿主植物限制，也受土壤速效氮、磷含量制約[19]。目前，土壤速效磷含量對(duì)菌根侵染率的影響已被深入研究[20-21]，相對(duì)而言，氮添加處理對(duì)菌根侵染率的影響研究較少。已有研究結(jié)果表明，土壤中速效氮含量過高會(huì)降低AM真菌對(duì)宿主植物的侵染[22]，而在氮素缺乏的地區(qū)，施氮?jiǎng)t有利于AM真菌對(duì)宿主植物的侵染[23]。本研究中，在未施氮處理組，AM真菌的菌根侵染率和泡囊侵染率均最高，且隨著氮水平的不斷增加，AM真菌的菌根侵染率和泡囊侵染率逐漸降低，Jiang等[11]在模擬氮沉降對(duì)青藏高原優(yōu)勢(shì)種垂穗披堿草的生長(zhǎng)效應(yīng)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)氮添加逐漸降低了AM真菌的菌根侵染率。張彩麗[24]從超微結(jié)構(gòu)上得出，氮添加對(duì)植物根系造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體腫脹、細(xì)胞質(zhì)分解等現(xiàn)象。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)叢枝受氮添加的影響不大，這可能和叢枝的特性有關(guān)。不同于泡囊和菌絲，叢枝在植物根系皮層細(xì)胞內(nèi)的壽命較短，一般新形成的叢枝1~2周就會(huì)被植物根系細(xì)胞的內(nèi)分泌酶消化掉，目前理論尚不能解釋為什么叢枝的壽命如此之短。

氮、磷是植物生長(zhǎng)不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素，參與了植物體內(nèi)許多重要化合物的組成及代謝途徑[25]。前人的研究表明，接種AM真菌可以促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤氮、磷的吸收，尤其在土壤養(yǎng)分匱乏的地區(qū)[26-28]。本研究中在未施肥處理組（N0）中，接種AM真菌顯著提高了高粱的地上生物量及組織氮、磷含量，這與徐如玉等[27]的研究一致。AM真菌對(duì)宿主植物的促生作用主要得益于AM真菌密集的根外菌絲和無隔的菌絲內(nèi)壁。通過AM真菌菌絲的磷轉(zhuǎn)運(yùn)要比通過植物根系的磷轉(zhuǎn)運(yùn)效率高10倍左右，植物體內(nèi)約90%的磷和25%的氮是通過AM真菌的菌絲獲得[29]；此外，AM真菌提高植物營(yíng)養(yǎng)吸收的原因還在于其土壤里密集的根外菌絲，尤其土壤中的速效磷容易受土壤膠體吸附，擴(kuò)散系數(shù)低，隨著土壤中植物根系對(duì)磷的吸收，很快就會(huì)形成一個(gè)磷匱乏區(qū)，而AM真菌的根外菌絲網(wǎng)可以達(dá)到植物根系到達(dá)不了的地方，擴(kuò)大了植物根系的吸收面積，大大增加了植物對(duì)磷的吸收[30]。

AM真菌對(duì)宿主植物的促生效應(yīng)與土壤環(huán)境條件密切相關(guān)。在一定土壤養(yǎng)分范圍內(nèi)，菌根的促生效應(yīng)隨土壤養(yǎng)分的減少而增強(qiáng)，原因在于土壤養(yǎng)分較低時(shí)，植物生長(zhǎng)受限，光合作用產(chǎn)物向根系及AM真菌分配減少，此時(shí)適當(dāng)施肥便能增加AM真菌侵染，從而增加宿主植物對(duì)土壤速效養(yǎng)分的吸收，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育，大部分的研究證明了這一點(diǎn)[10,31-32]。此外，AM真菌和土壤養(yǎng)分在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面存在交互作用，一方面，植物的生長(zhǎng)需要充足的氮源；另一方面，過量的氮素又會(huì)抑制AM真菌和宿主植物的共生，進(jìn)而影響菌根的有益效應(yīng)[33]。本研究分析高粱的生物量及組織氮磷含量，發(fā)現(xiàn)隨著氮添加量的增加，菌根對(duì)植物的有益效應(yīng)由正效應(yīng)（共生關(guān)系）逐漸變?yōu)樨?fù)效應(yīng)（寄生關(guān)系），這一點(diǎn)和Jiang等[11]的研究結(jié)果一致。主要是由于高水平氮添加情況下，植物通過根系可以吸收氮素滿足植物生長(zhǎng)需求，而不需要額外負(fù)擔(dān)真菌的營(yíng)養(yǎng)分配，高氮水平下的低菌根侵染率可以很好地說明這一點(diǎn)。本試驗(yàn)表明，在低水平氮添加下，接種AM真菌可以提高高粱的氮磷含量及生物量，而在高氮條件下，接種AM真菌高粱組織氮磷含量及生物量不升反降。因此，要充分發(fā)揮AM真菌的菌根效應(yīng)，需首先了解當(dāng)?shù)氐耐寥鲤B(yǎng)分條件，尤其在全球氮沉降背景加劇的情況下。此外，氮沉降導(dǎo)致高粱生物量降低，一定程度上也是因?yàn)楦叩较拢珹M真菌和宿主植物處于一種寄生關(guān)系，AM真菌在不需要消耗能量的情況下，參與宿主植物的光合產(chǎn)物分配，最后以根外菌絲、孢子及其次級(jí)代謝產(chǎn)物（球囊霉素）的形式存在。研究表明AM真菌孢子以及球囊霉素是土壤碳庫(kù)的重要組成部分[34]，AM真菌在土壤高氮水平下，一定程度上減緩了土壤碳的釋放。

終上所述，接種AM真菌顯著增加了高粱的菌根侵染率，隨著氮濃度的增加，高粱菌根侵染率和泡囊侵染率逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌和模擬氮沉降對(duì)高粱的菌根生長(zhǎng)效應(yīng)（MGR）、菌根氮吸收效應(yīng)（MNR）及菌根磷吸收效應(yīng)（MPR）存在顯著的交互效應(yīng)。未施氮處理（N0）時(shí)，接種AM真菌顯著促進(jìn)了高粱的MGR、MNR以及MPR；但隨著氮梯度的增加，高粱的MGR、MNR以及MPR逐漸由正效應(yīng)轉(zhuǎn)為負(fù)效應(yīng)，當(dāng)模擬氮沉降濃度達(dá)到400 mg·kg-1（N2）時(shí)，接種AM真菌顯著抑制了高粱的MNR以及MPR；當(dāng)模擬氮沉降濃度繼續(xù)增加到 500 mg·kg-1（N3）時(shí)，高粱的 MGR、MNR以及MPR均受AM真菌抑制。本試驗(yàn)選用的是單一的AM菌種，不同的AM菌種，尤其是混合菌種對(duì)氮的耐受性不盡一致，且本研究所采用的盆栽試驗(yàn)，與外界大田所處的氮沉降仍會(huì)有一定差異，后期需進(jìn)一步研究。