益母草堿通過調節cAMP/PKA信號通路抑制脊髓損傷大鼠神經細胞凋亡

趙曼云， 郭蔚虹， 張 霞

(海口市120急救中心急救科，海南 海口 570208)

脊髓損傷是臨床上常見的高致殘率中樞神經系統疾病，當脊髓被直接或間接暴力損傷后會出現組織水腫、血管-脊髓屏障損傷和神經元壞死等現象，使神經再生被抑制，進而使神經系統功能受到破壞[1]。脊髓損傷后的再生修復是當前神經科學領域的研究熱點之一，中和或阻斷髓鞘組織中的抑制成分或相關信號通路是目前治療脊髓損傷及促進其修復的主要策略[2-3]。環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是細胞內重要的信使，在哺乳動物中樞神經系統干細胞分化和增殖過程中起著重要作用，可以通過激活蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)促進神經再生，且cAMP/PKA信號通路被證明是神經再生、神經重塑的重要調節因子[4-6]。益母草堿是唇形科植物益母草的主要有效成分之一，具有保護心血管、神經系統、腎臟、生殖系統的作用及抗糖尿病等藥理用途[7]，并對cAMP/PKA信號通路介導的中樞神經系統功能障礙具有預防和治療作用[8]，可能通過調節cAMP/PKA信號通路對脊髓損傷后的神經細胞凋亡有一定的抑制作用。因此，本研究探討益母草堿對脊髓損傷后神經功能的保護作用及可能機制，為相關防治提供新思路和依據。

1 材料

1.1 動物 75只SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量(220±20)g，由海南省疾病預防控制中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK(瓊)2020-0012，常規飼養于安靜通風環境下，室內溫度20～24 ℃, 相對濕度50%～65%，循環照明12 h/12 h，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 試劑與藥物 益母草堿(純度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號190225)。PKA通路抑制劑H-89(美國MedChemExpress公司，批號633210)；caspase-3、環磷酸腺苷(cAMP)ELISA檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、蛋白激酶A(PKAc)、環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)、磷酸化的CREB[p-CREB (Ser133)]、腦源性神經營養因子(BDNF)、GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TUNEL凋亡試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 儀器 電泳儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；RT-qPCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥 75只SD大鼠隨機分為假手術組，模型組，益母草堿低、高劑量組，高劑量益母草堿+PKA抑制劑H-89組(益母草堿+H-89組)，每組15只。采用改良Allen’s打擊法建立脊髓損傷模型[9]，以T10為中心剃毛，消毒后作手術切口暴露T9-T11棘突，暴露T10對應的脊髓，用20 g擊打棍從3 cm高度自由落體撞擊T10骨窗對應的脊髓，當大鼠尾巴出現痙攣性擺動、雙下肢迅速回縮并揮動，受撞擊的脊髓組織水腫、出血，硬脊膜完整呈紫紅色的現象時，認為模型制備成功；假手術組僅暴露T10對應的脊髓，不進行打擊。造模成功后即開始腹腔注射給藥干預，益母草堿低、高劑量組分別注射4、16 mg/kg益母草堿，益母草堿+H-89組在注射16 mg/kg益母草堿的基礎上再注射5 mg/kg的H-89，假手術組和模型組注射等量生理鹽水，每天1次，連續4周。

2.2 運動功能評價 分別于造模后第7、14、21、28天進行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分和斜板角度評估各組大鼠運動功能。BBB運動評分[10]方法為早期以無或極少的后肢關節運動為特征，中期出現幾次共濟失調步態，晚期表現為拖著腳趾和尾巴、軀干不穩定以及爪子交替輪轉。將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分，記錄2次有效評分，取均值。斜板角度[11]檢測方法為，將大鼠頭朝左橫放在Rivlin斜板上，并從水平位置逐步增大傾斜角度，以大鼠在斜板上停留5 s不掉落為標準，測定斜板角度，獲取5次有效角度，取平均值。

2.3 HE染色觀察脊髓組織病理學變化 藥物干預28 d后，10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉大鼠后開胸，從左心室插管至主動脈，自心尖灌注生理鹽水和4%多聚甲醛固定2 h，取以脊髓損傷點為中心的上下各5 mm節段的脊髓組織，置于4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片(片厚4 μm)，按照試劑盒說明書進行HE染色，于光鏡下觀察脊髓組織結構、炎癥細胞浸潤。

2.4 TUNEL染色檢測脊髓組織神經細胞凋亡情況 取“2.3”項下制備的切片，按照TUNEL染色試劑盒說明書進行透化、PBS漂洗、封閉、標記、蘇木素復染、脫水、透明、封片等步驟后，于顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。每張切片隨機取5個視野進行計數統計，凋亡率=[凋亡細胞核數(陽性細胞數)/總細胞核數(總細胞數)]×100%。

2.5 ELISA檢測脊髓組織中caspase-3和cAMP水平 取各組大鼠損傷的脊髓組織，加入裂解液冰浴超聲勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，吸取等量上清液和不同濃度的標準品，根據ELISA檢測試劑盒說明說進行操作，通過酶標儀檢測450 nm波長處各孔光密度(OD450)值，以陰性對照孔調零，根據標準液的檢測結果得出標準曲線，計算各組脊髓組織中caspase-3和cAMP水平。

2.6 RT-qPCR檢測脊髓組織中PKAc和BDNFmRNA表達 脊髓組織在冰上勻漿器中剪碎，加入TRIzol研磨混勻提取樣本總RNA，紫外分光光度計檢測各樣本總RNA濃度。取2 μg總RNA采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR擴增。反應條件為95 ℃預變性10 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸31 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用2-△△CT法計算各基因的mRNA相對表達量。PKAc正向引物序列5′-GCTGGCTTTGATTTACGG-3′，反向引物序列5′-GATGTTTCGCTTGAGGATA-3′；BDNF正向引物序列5′-CATCTTAGGAGTGGAAAGGGTG-3′，反向引物序列5′-TATGAAGCCACCTAATCGACCT-3′；β-actin正向引物序列5′-GATGACCCAGATCATGTTTGA-3′，反向引物序列5′-TTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。

2.7 Western blot檢測脊髓組織中PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF及凋亡相關蛋白表達 取脊髓組織剪碎勻漿，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量后使蛋白變性，取等量蛋白進行凝膠電泳分離并轉膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，4 ℃孵育稀釋后的一抗[cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF、β-actin，1∶1 000]過夜，次日清洗后加入相應HRP標記的二抗孵育2 h，洗滌后，加入顯影液顯影成像。使用β-actin抗體進行內參校正，采用Image J軟件對條帶灰度值進行分析，用目的蛋白與β-actin灰度值比表示目的蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 益母草堿對脊髓損傷大鼠運動功能的影響 如圖1所示，除假手術組外，給藥7 d時各組大鼠BBB評分和斜板角度無顯著性差異(P>0.05)。給藥14、21、28 d時，與假手術組比較，模型組大鼠BBB評分和斜板角度降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組BBB評分和斜板角度增加(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組BBB評分和斜板角度降低(P<0.01)。給藥時間越長，益母草堿高劑量組大鼠后肢功能恢復越好。

3.2 益母草堿對脊髓損傷大鼠脊髓組織病理損傷的影響 如圖2所示，假手術組脊髓組織結構完整、致密整齊，細胞結構完好，核大而圓且核仁清晰；模型組和益母草堿低劑量組脊髓組織結構破壞嚴重，細胞核出現明顯固縮，伴有大量炎性細胞浸潤；益母草堿高劑量組和益母草堿+H-89組脊髓組織結構紊亂情況有明顯改善，炎性細胞浸潤減少。

3.3 益母草堿對脊髓損傷大鼠脊髓組織神經細胞凋亡的影響 假手術組、模型組、益母草堿低劑量組、益母草堿高劑量組和益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織中caspase-3水平分別為(16.5±1.3)、(66.8±2.0)、(67.0±1.5)、(32.5±1.0)、(48.3±1.2)μg/L。與假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織中caspase-3水平升高(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織中caspase-3水平降低(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織中caspase-3水平升高(P<0.01)。如圖3～4所示，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織神經細胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達均升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織神經細胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達均降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織神經細胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表達均升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01)。

3.4 益母草堿對脊髓損傷大鼠脊髓組織中PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF表達及cAMP水平的影響 假手術組、模型組、益母草堿低劑量組、益母草堿高劑量組和益母草堿+H-89組大鼠脊髓組織中cAMP水平分別為(33.2±1.8)、(11.1±0.8)、(11.9±1.2)、(24.2±1.3)、(23.7±0.9)μg/L。與假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織中cAMP水平降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織中cAMP水平升高(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組脊髓組織中cAMP水平降低(P<0.01)。如圖5所示，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，益母草堿高劑量組大鼠脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表達升高(P<0.01)，益母草堿低劑量組無顯著性差異(P>0.05)；與益母草堿高劑量組比較，益母草堿+H-89組脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表達均降低(P<0.01)。

4 討論

前期研究顯示，提高神經元內cAMP/PKA水平或激活該通路信號分子可增強其內在的再生能力，有效地促進脊髓再生[12-15]。益母草堿是從中藥益母草中提取的具有顯著生物活性的生物堿，在心腦血管病、糖尿病、腎病、生殖等方面有許多新用途[16-17]，但益母草堿對脊髓損傷后的神經細胞是否具有保護作用，尚未有文獻報道。

本研究采用改良Allen’s打擊法建立脊髓損傷大鼠模型，并連續4周腹腔注射給予不同劑量益母草堿，以探究其對脊髓損傷的作用。研究結果顯示，模型大鼠的BBB評分和斜板實驗評分均降低，大鼠后肢運動功能受到影響，與前人研究一致[18]，說明模型復制成功。同時，HE病理染色結果顯示，模型大鼠脊髓組織出現明顯水腫，細胞核明顯固縮，伴有大量炎性細胞浸潤；給予高劑量益母草堿干預給藥后，大鼠脊髓組織水腫和炎性細胞浸潤程度明顯減輕，后肢運動功能得到明顯改善，表明益母草堿對脊髓損傷大鼠有明顯的保護作用。

脊髓損傷導致的神經功能永久或長期喪失與脊髓組織的水腫、變性、壞死，以及神經細胞的凋亡是緊密相關[10]。caspase家族蛋白介導細胞凋亡，下調caspase-3在大鼠脊髓損傷神經元中表達，抑制神經細胞凋亡，對損傷后神經組織再生和修復有積極的治療作用[19]。本研究結果顯示，模型大鼠脊髓組織凋亡細胞增多，caspase-3蛋白表達升高；給予高劑量益母草堿干預能抑制模型大鼠神經細胞凋亡，說明它能通過調節脊髓損傷大鼠脊髓組織中凋亡因子的表達抑制細胞凋亡，減輕脊髓損傷程度。

BDNF是一種具有促進神經生長活性的蛋白質，在維持神經元功能、防止神經元退行性變以及神經元損傷后再修復過程中發揮重要的作用。CREB磷酸化后形成的p-CREB可作為調控因子誘導BDNF基因的表達，而PKAc蛋白可通過促進CREB蛋白磷酸化(Ser133)激活，促進靶基因BDNF的轉錄，進而促進神經細胞存活[20]。本研究結果顯示，脊髓損傷大鼠脊髓組織中PKAc、p-CREB(Ser133)和BDNF的mRNA及蛋白表達均降低，說明脊髓損傷后cAMP/PKA信號通路被抑制；高劑量益母草堿干預能夠逆轉脊髓損傷對cAMP/PKA信號通路的抑制程度，表明它可能是通過激活cAMP/PKA信號通路來抑制神經細胞凋亡、減輕脊髓組織損傷，從而改善大鼠后肢運動功能，促進脊髓損傷的修復。

綜上所述，益母草堿能通過激活cAMP/PKA信號通路，減輕脊髓組織病理損傷，減少神經細胞凋亡，促進脊髓損傷大鼠后肢運動功能的恢復。此研究首次探究了益母草堿對脊髓損傷的作用，可為其治療提供新的潛在藥物。