知母水提取物對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27的抑制作用

朱建新， 顏 娟， 趙虹琇， 姜愛(ài)雯， 張 藝

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，由于胃癌細(xì)胞具有增殖迅速，侵襲能力強(qiáng)，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和對(duì)化療藥物具有耐藥性等原因，使得其致死率高居第二位[1]。目前，胃癌的治療主要采取以手術(shù)為主化療為輔的方案，盡管治療技術(shù)不斷改進(jìn)，但仍有部分胃癌患者就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)移，治療效果不佳[2-3]。所以，除了加強(qiáng)早期診斷之外，探尋一種行之有效的天然抗腫瘤的藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

知母為百合科植物知母的干燥根莖，性苦、甘、寒，歸胃、肺經(jīng)，是常用的清熱瀉火類(lèi)藥物，具有降低血脂、抗血栓形成、預(yù)防老年癡呆、保護(hù)腦損傷及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。除此之外，知母還具有抑制腫瘤增殖和侵襲的作用。研究發(fā)現(xiàn)，知母皂苷AⅢ可以通過(guò)抑制COX-2表達(dá)，進(jìn)而降低NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)來(lái)抑制黑色素瘤B16-F10細(xì)胞系與WM-115細(xì)胞系遷移能力及裸鼠成瘤能力[5]。測(cè)序分析及生物信息學(xué)技術(shù)指出知母水提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞系SGC7901中miR-26b-5p、miR-16-5p、miR-15b-5p、miR-20-5P表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因群來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力[6]。本實(shí)驗(yàn)選取胃癌細(xì)胞系HGC-27為對(duì)象，深入研究知母對(duì)胃癌的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞系HGC-27購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑與藥物 知母顆粒劑(批號(hào)1602043)購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司。RPMI1640、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人MMP-9(貨號(hào)RLT1892)、鼠抗人β-actin(貨號(hào)RLM3028)、鼠抗人MMP-2(貨號(hào)RLM3667)、兔抗人Slug(貨號(hào)RLM3371)、兔抗人E-cadherin(貨號(hào)RLM3353)、兔抗人E-Selectin(貨號(hào)RLT5745)購(gòu)自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)CoStar公司；纖維粘連蛋白(貨號(hào)356234)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)BD公司；牛血清白蛋白封閉液(貨號(hào)SW3015)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HGC-27細(xì)胞于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率至90%～95%時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 知母水提取物制備與細(xì)胞分組 使用RPMI1640培養(yǎng)基溶解知母顆粒劑，在無(wú)菌條件下制備成終質(zhì)量濃度為1、5、10、15 mg/mL的藥液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ⅰ?.1”項(xiàng)下細(xì)胞分為對(duì)照組，知母水提取物1、5、10 mg/mL組。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后種于96孔板中，每孔約1×105個(gè)，培養(yǎng)12 h后分別加入1、5、10、15 mg/mL知母水提取物，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，每孔加入15 μL 1 mg/mL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，離心，倒去培養(yǎng)液并加入100 μL DMSO，10 min后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活情況 用知母水提取物將HGC-27細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)后，按照每孔500個(gè)的密度接種于6孔板中，加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)7 d。至長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)后，PBS洗去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定10 min，染色，計(jì)算細(xì)胞團(tuán)數(shù)(細(xì)胞大于50)。

2.5 細(xì)胞同質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞粘附能力 用知母水提取物處理36 h后，將HGC-27細(xì)胞制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，每孔200 μL，接種于48孔板，孵育1 h后PBS洗去未粘附細(xì)胞，計(jì)算同質(zhì)粘附細(xì)胞數(shù)，公式為同質(zhì)粘附細(xì)胞數(shù)=每孔加入總細(xì)胞數(shù)-洗去未粘附細(xì)胞數(shù)。

2.6 細(xì)胞異質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞粘附能力 使用15 mg/L纖維粘連蛋白包被48孔板，置于無(wú)菌條件下吹干后，2%牛血清白蛋白封閉2 h，將各組細(xì)胞制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，每孔200 μL接種于48孔板，培養(yǎng)60 min后PBS洗去未粘附細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，計(jì)算異質(zhì)粘附細(xì)胞數(shù)。

2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將HGC-27細(xì)胞制成密度為5×105/mL的細(xì)胞懸液，每孔500 μL、接種24孔板中，待到細(xì)胞融合率達(dá)到95%～100%時(shí)，用20 μL槍頭筆直在孔板中央進(jìn)行劃痕，PBS沖洗掉脫落細(xì)胞后，加入含1、5、10 mg/mL知母水提取物的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，拍照觀察。

2.8 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將各組HGC-27細(xì)胞用含0、1、5、10 mg/mL知母水提取物的無(wú)血清培養(yǎng)液制成密度為5×106/mL的細(xì)胞懸液，將100 μL細(xì)胞懸液加進(jìn)提前用纖維黏連蛋白包被的Transwell小室上室，下室加入含10% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后擦去上室上面未侵襲的細(xì)胞，多聚甲醛固定15 min，吉姆薩染色，拍照觀察。

2.9 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞MMP-9、MMP-2、Slug、E-cadherin、E-Selectin蛋白表達(dá) 用知母水提取物處理HGC-27細(xì)胞48 h后，提取HGC-27細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)各

組蛋白濃度。每孔15 μL蛋白上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉1 h，加入MMP9(1∶500)、MMP2(1∶150)、Slug(1∶150)、E-cadherin(1∶100)、E-Selectin(1∶200)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗后，加入二抗孵育1 h，ECL發(fā)光顯色，通過(guò)成像儀自帶的軟件測(cè)量條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 知母水提取物對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖能力的影響 與對(duì)照組比較，知母水提取物各劑量組細(xì)胞增殖率均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖1；知母水提取物各劑量組細(xì)胞克隆形成數(shù)均減少(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖2、表1，提示知母水提取物能抑制HGC-27細(xì)胞增殖。

表1 知母水提取物對(duì)HGC-27細(xì)胞克隆形成能力的影響

3.2 知母水提取物對(duì)HGC-27細(xì)胞粘附能力的影響 與對(duì)照組比較，知母水提取物各劑量組細(xì)胞同、異質(zhì)粘附細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.01)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖3。

3.3 知母水提取物對(duì)HGC-27細(xì)胞遷移能力的影響 與對(duì)照組比較，知母水提取物各劑量組細(xì)胞劃痕面積均增加，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖4，提示知母水提取物能抑制HGC-27細(xì)胞遷移能力。

3.4 知母水提取物對(duì)HGC-27細(xì)胞侵襲能力的影響 與對(duì)照組比較，知母水提取物各劑量組HGC-27細(xì)胞侵襲能力均被抑制，見(jiàn)圖5。

3.5 知母水提取物對(duì)HGC-27細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、Slug、E-cadherin、E-Selectin蛋白表達(dá)影響 與對(duì)照組比較，知母水提取物各劑量組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、Slug、E-Selectin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖6、表2。

4 討論

我國(guó)目前東西部醫(yī)療水平發(fā)展極不平衡，各級(jí)醫(yī)院對(duì)于胃癌的診治水平也不盡相同，許多患者在首診時(shí)已經(jīng)處于胃癌的晚期階段，即使進(jìn)行手術(shù)切除或放化療，胃癌復(fù)發(fā)率、致死率很高，5年生存率低[7]。知母作為抗腫瘤藥物之一，近年來(lái)受到的關(guān)注也越來(lái)越多。

癌癥出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素是癌細(xì)胞粘附能力的改變[8]。腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)粘附能力改變后，原有的細(xì)胞連接被重新排列。本實(shí)驗(yàn)中同質(zhì)細(xì)胞粘附能力是指胃癌HGC-27細(xì)胞之間粘附的能力，異質(zhì)細(xì)胞粘附能力是指胃癌HGC-27細(xì)胞與正常基底細(xì)胞之間的粘附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)知母水提取物處理HGC-27細(xì)胞后，同質(zhì)細(xì)胞粘附能力增強(qiáng)，提示知母水提取物可以使HGC-27細(xì)胞相互連接更加緊密不易出現(xiàn)向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象；異質(zhì)細(xì)胞粘附數(shù)減少，提示知母水提取物可以使HGC-27細(xì)胞與人正常基底面細(xì)胞結(jié)合能力下降，從而減低了胃癌HGC-27細(xì)胞轉(zhuǎn)移后定植在局部的可能性。說(shuō)明知母水提取物可以在癌癥發(fā)生的第1個(gè)階段就通過(guò)抑制粘附能力來(lái)降低胃癌HGC-27細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能性。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，知母水提取物可以抑制HGC-27細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)移植人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的裸鼠

表2 知母水提取物對(duì)HGC-27細(xì)胞MMP-9、MMP-2、Slug、E-cadherin、E-Selectin蛋白表達(dá)的影響

接種知母皂苷AⅢ后，瘤體生長(zhǎng)處于抑制狀態(tài)，并呈劑量依賴(lài)性；同時(shí)，在體外使用知母皂苷AⅢ處理U87MG細(xì)胞后，作為粘附分子代表的β-catenin表達(dá)降低，人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞異質(zhì)粘附能力降低[9]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

腫瘤加強(qiáng)侵襲和遷移能力是癌癥發(fā)生的又一重要階段，通過(guò)釋放MMP-9、MMP-2蛋白致使癌細(xì)胞穿過(guò)基底膜繼而降解細(xì)胞外基質(zhì)向遠(yuǎn)處組織或淋巴結(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)移[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HGC-27細(xì)胞的遷移、侵襲能力可被知母水提取物抑制，并呈劑量依賴(lài)性，知母水提取物還可通過(guò)抑制MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)HGC-27細(xì)胞的遷移、侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程中的2個(gè)關(guān)鍵因子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，知母水提取物可以抑制轉(zhuǎn)錄因子Slug及恢復(fù)E-cadherin蛋白表達(dá)，提示知母水提取物可能通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程中來(lái)抑制對(duì)HGC-27細(xì)胞的惡性進(jìn)程[11]。另外，E-Selectin是調(diào)節(jié)異質(zhì)粘附能力的關(guān)鍵分子[12]，而知母水提取物可以促進(jìn)E-Selectin蛋白表達(dá)，這與細(xì)胞異質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)一致。

綜上所述，知母水提取物可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程進(jìn)而降低轉(zhuǎn)錄因子Slug與MMP-9、MMP-2、E-Selectin蛋白表達(dá)，升高E-cadherin蛋白表達(dá)，從而抑制HGC-27細(xì)胞的粘附、增殖、遷移和侵襲能力。