姜黃素對鈦顆粒誘導的小鼠氣囊植骨模型溶骨的保護作用

劉子歌， 張 晨， 宋國瑞， 李 燕， 郭鳳英， 劉心蕊， 陳德勝

(1.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏 銀川 750004；2.生育力保持教育部重點實驗室寧夏生殖與遺傳重點實驗室，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏回族自治區人民醫院骨科，寧夏 銀川 750004)

人工關節置換術是治療終末期關節疾病最成功的手術之一。然而，假體周圍骨溶解和隨后出現的無菌性松動是人工關節置換術失敗的主要原因[1]。目前，翻修手術是治療無菌性松動的唯一有效方法。近年來，與無菌性松動相關的研究主要集中在藥物于分子水平上調節破骨細胞前體細胞向成熟破骨細胞分化和炎癥反應的機制[2]。假體周圍骨溶解的發病機制涉及促炎細胞因子的產生、破骨細胞的激活和磨粒刺激后的骨丟失。核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路是磨損顆粒誘導骨溶解的潛在重要治療靶點之一[3]。

姜黃素是從姜黃的根中分離出來的一種生物相容性較好的多酚化合物。研究發現，它可以防止卵巢切除術引起的骨質流失并增強骨骼[4]。姜黃素可能通過抑制促炎性介質腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)來減輕炎癥反應，并通過抑制NF-κB信號轉導通路活化來調節細胞免疫應答[5]。基于此，姜黃素被認為是預防假體周圍骨溶解和人工關節無菌性松動的潛在候選藥物。然而，在顆粒誘導的骨溶解過程中，姜黃素的抗骨吸收能力是否與RANKL/骨保護素(OPG)信號系統相關也尚不清楚。本研究采用小鼠氣囊植骨模型，研究姜黃素對鈦顆粒誘導的骨溶解作用的影響及其相關的細胞信號轉導途徑。

1 材料

1.1 動物 8～10周齡雌性SPF級BALB/c小鼠，體質量(22±3)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SYXK(京)2015-0027，飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心，實驗動物倫理委員會審查編號2015-019。

1.2 試劑與藥物 姜黃素(美國MCE公司，純度96.31%，批號09276)。納米級鈦顆粒(美國Alfa Aesar公司，批號7440-32-6)；內毒素檢測鱟試劑盒(廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，貨號EC80545)；血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)診斷試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C00921、C01021、C01121、C01321)；TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG、RANKL ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司，貨號bsk12002、bsk12015、bsk12004、bsk11028、bsk12048)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒、DMSO、實驗用玉米油(美國Sigma公司，貨號CS0740、D2650、C8267)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號RR014A、638315)。

1.3 儀器 EG1150型組織包埋機、RM2265型全自動輪轉切片機等病理設備(德國Leica公司)；H-7650型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；IX71型光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 姜黃素、鈦顆粒的制備 采用5% DMSO將姜黃素配制成質量濃度為5 mg/mL的溶液，玉米油定容至25 mg/kg，現配現用。通過投射電子顯微鏡觀察納米級鈦顆粒，確定99%的顆粒直徑小于10 μm(圖1)，用70%乙醇浸泡滅菌48 h，無菌磷酸鹽緩沖鹽(PBS)洗滌3次，去除顆粒中附著的內毒素，嚴格按照內毒素檢測試劑盒說明書進行檢測，結果為小于0.05 EU/mL，確認用于實驗的鈦顆粒中無內毒素，將鈦顆粒懸浮在質量濃度為1 mg/mL的無菌PBS中備用。

2.2 建模、分組與給藥 參考文獻[6-7]報道，建立小鼠氣囊植骨模型。麻醉小鼠后在其背部注射2 mL無菌空氣形成氣囊，每天向氣囊中注射0.5 mL無菌空氣，連續6 d，第7天氣囊形成；另選小鼠處死，取出其顱骨骨片，剔除多余的軟組織。切開氣囊，植入小鼠顱骨骨片，縫合切口。將30只小鼠隨機分為空白組(PBS)、模型組(PBS混懸鈦顆粒)、姜黃素組(25 mg/kg姜黃素混懸鈦顆粒)，每組10只。造模成功后第2天，模型組和姜黃素組小鼠氣囊注射0.1 mg/mL 鈦顆粒懸浮液0.1 mL，空白組小鼠氣囊注射等體積PBS；姜黃素組小鼠腹腔注射25 mg/kg姜黃素，空白組和模型組小鼠腹腔注射等體積PBS，每天1次，連續14 d。14 d后將小鼠脫頸處死，收集具有完整顱骨植入物及氣囊組織，用于后續形態學與分子生物學分析。

2.3 小鼠組織學形態觀察 將收集好的組織進行蠟塊包埋，切成5 μm薄片，對植入小鼠顱骨骨片進行HE和TRAP染色，顯微鏡檢查染色切片的圖像，并截取有代表性的圖片。參考文獻[8]報道，光鏡下確定氣囊的厚度和植入骨片被腐蝕的面積，研究骨吸收程度，骨吸收處附近紫色顆粒的數量為TRAP陽性細胞。將收集到的組織用2%戊二醛和1%鋨酸先后固定，石蠟包埋切片后，收集到鍍有Fomvar膜的銅網上，5%乙酸鈾酰染色4 min，檸檬酸鉛染色2 min，在透射電子顯微鏡下觀察切片，所有切片采用雙盲法由2位實驗員獨立閱片，并進行最終結果評定。

2.4 RT-qPCR法檢測小鼠顱骨組織中TRAP、NFATc1、OPG、RANKLmRNA表達 取小鼠氣囊組織70 mg，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉錄酶和cDNA合成試劑盒合成cDNA，使用SYBR GREEN試劑盒，提取1 μL cDNA進行聚合酶鏈反應，檢測各組小鼠顱骨組織中TRAP、NFATc1、OPG、RANKLmRNA表達，以β-actin為內參基因，計算各目的基因相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法檢測小鼠植入顱骨組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG、RANKL水平 在無菌條件下解剖并收集小鼠植入顱骨(每組3只)，在37 ℃、5% CO2下，用含1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養基培養24 h，800 r/min離心5 min，收集培養液，采用ELISA試劑盒檢測小鼠植入顱骨培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG、RANKL水平。

2.6 小鼠肝腎功能檢測 實驗結束時采集各組小鼠血液，3 000 r/min離心15 min，得上層血清，采用診斷試劑盒檢測血清中ALT、AST、Cre、BUN活性。

3 結果

3.1 姜黃素對小鼠鈦顆粒誘導的骨溶解的影響 模型組小鼠破骨細胞膜皺褶似偽足狀，細胞核擴大，細胞質豐富，其中含有大量粗糙的內質網核線粒體，溶酶體數量增加，在骨組織表面可以觀察到溶骨性變化；姜黃素組小鼠由鈦顆粒引起的骨丟失減少，破骨細胞質內溶體核線粒體的數量減少，破骨活躍程度降低。與空白組比較，模型組小鼠植入顱骨的氣囊袋組織增厚，氣囊袋組織中觀察到大量的巨噬細胞，淋巴細胞和其他炎癥細胞，炎癥反應強烈，且在骨膜界面區域有糜爛點；與模型組比較，姜黃素組小鼠顱骨植入袋的厚度減少(P<0.01)，見圖2，提示姜黃素在體內對磨損顆粒誘導的骨吸收具有保護作用。

3.2 姜黃素對小鼠鈦顆粒誘導破骨細胞形成的影響 模型組小鼠顱骨組織破壞嚴重，在侵蝕坑處可見緊密排列的紫色顆粒，見圖3A。每1個高倍鏡視野下，模型組小鼠顱骨組織TRAP染色陽性細胞數為(78.17±9.72)個；與模型組比較，姜黃素組小鼠顱骨組織TRAP陽性細胞數量減少(P<0.01)，為(43.33±5.22)個，見圖3B。

3.3 姜黃素對小鼠破骨細胞中TRAP、NFATc1、OPG、RANKLmRNA表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠破骨細胞中TRAP、NFATc1、RANKLmRNA表達升高(P<0.01)，OPGmRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組小鼠破骨細胞中TRAP、NFATc1、RANKLmRNA表達降低(P<0.01)，OPGmRNA表達升高(P<0.01)，見圖4。

3.4 姜黃素對小鼠植入顱骨中TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL水平的影響 與空白組比較，對照組小鼠植入顱骨中鈦顆粒OPG水平降低(P<0.01)，TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL水平及RANKL/OPG比值升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組小鼠植入顱骨中鈦顆粒OPG水平升高(P<0.01)，TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL水平及RANKL/OPG比值降低(P<0.01)，見圖5，提示姜黃素可以逆轉鈦顆粒刺激后RANKL/OPG比值的失衡。

3.5 各組小鼠肝腎功能檢測 與空白組比較，姜黃素組小鼠血清中ALT、AST、Cre、BUN活性無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠肝腎功能水平

4 討論

姜黃素是從香料姜黃中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗感染等作用[9-11]。人工關節無菌性松動由假體來源的磨損顆粒的激活、巨噬細胞的募集和破骨細胞局部炎癥反應啟動，從而導致骨吸收[12]。研究發現，姜黃素通過調節巨噬細胞極化來抑制鈦顆粒引起的炎癥[13-14]。活化的破骨細胞對于骨吸收至關重要[15]。因此，研究姜黃素減輕磨粒誘導的破骨細胞生成的效果與機制對治療骨溶解性疾病具有重要意義。本研究證實在鈦顆粒的刺激下會導致骨丟失，并且在小鼠顱骨組織中檢測出破骨細胞，在姜黃素的干預下能有效降低TRAP陽性破骨細胞。提示，姜黃素在預防與破骨細胞相關的磨損顆粒誘導的骨溶解方面起到積極作用。

RANKL對破骨細胞的激活、分化和成熟有十分重要的功能，而OPG是RANKL的天然拮抗受體，可以下調破骨細胞特異性基因表達和破骨細胞生成。研究表明，患者滑膜或關節滑液中RANKL和OPG表達的比值對假體周圍骨溶解的發生至關重要[16-17]。本研究認為，姜黃素是通過抑制RANKL/RANK信號通路，從而抑制破骨細胞的形成和治療磨損顆粒誘導的骨溶解。磨損顆粒的吞噬作用引起炎癥反應和促炎細胞因子的釋放，從而促進破骨細胞活化和隨后的骨吸收[18]。此外，姜黃素對膠原誘導的關節炎也具有抗炎活性[19]。本研究證實，姜黃素可以抑制界面膜上的主要細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產生。因此，本研究認為姜黃素對促炎細胞因子的抑制作用有可能減輕磨損顆粒引起的慢性炎癥。

Hussan等[20]發現，高劑量姜黃素通過增加成骨細胞數對去卵巢大鼠骨丟失起到保護作用，與本研究對姜黃素的骨保護效應結果一致。然而，在Hussan的研究中，姜黃素被給予2個月的灌胃治療，而在本研究中，姜黃素只被腹腔注射了2周。因此，需要進一步的研究來探索給藥劑量、給藥時間和給藥途徑。

綜上所述，姜黃素可通過抑制RANKL信號通路來減輕鈦顆粒誘導的小鼠氣囊植骨模型的炎癥骨溶解，可能成為防治人工關節無菌性松動的候選化合物。