基于PI3K/Akt通路研究孕育丹糖漿防治大鼠多囊卵巢綜合征不孕癥的機制

徐云霞， 徐珺萍， 卞景新

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院婦產科，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種發病多因性、臨床表現多態性的內分泌疾病，患病率為8%～13%[1]，占無排卵不孕癥的80%[2]，具體發病機制尚未明確，其主要特征為高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變、排卵功能異常等，而且疾病呈進行性發展，易致女性生育功能障礙[3]。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是動物體內基礎信號通路，通路中許多分子參與調節卵母細胞的生長、原始卵泡的發育、顆粒細胞的增殖和分化等過程[4-6]。

中醫古籍中并無“PCOS”這一病名，根據其臨床特征將其歸屬于“不孕”“閉經”“癥瘕”等范疇[7]，其發病多與腎、脾、肝關系密切，單證型以腎虛證為主[8]。孕育丹糖漿是國家名老中醫徐志華教授以“腎藏精，主生殖”的中醫理論基礎為指導，以“溫腎暖宮，調補沖任”為治則，結合多年理論研究與臨床實踐創制的具有自主知識產權的特色醫院制劑，主治腎陽虛性不孕癥，臨床療效確切[9]。本實驗基于PCOS大鼠模型，觀察孕育丹糖漿對PI3K/Akt信號通路的調控作用，以期闡明其作用機制。

1 材料

1.1 動物 6周齡SPF級雌性SD大鼠60只，體質量(180±20)g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(皖)2017-001，飼養于安徽中醫藥大學動物房，飼養環境為室溫(22±2)℃，相對濕度 50%～70%，自由攝食飲水，適應性飼養7 d后開始實驗。本實驗經過安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準(審批號2022003)。

1.2 試劑與藥物 孕育丹糖漿(皖藥制字Z20050059)由熟地黃、鹽沙苑子、覆盆子、枸杞子、鹽菟絲子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、鹽補骨脂、肉蓯蓉、鎖陽、燙狗脊、當歸組成。枸櫞酸氯米芬(進口藥品注冊證號H20140688)購自塞浦路斯高特制藥有限公司；來曲唑(國藥準字H19991001)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。羧甲基纖維素溶液(carboxylmethtl cellulose,CMC,1%，批號130225)購自伊勢久(江蘇連云港)生物科技有限責任公司；促卵泡素(FSH)定量檢測試劑盒(貨號RX302805R)、黃體生成素(LH)定量檢測試劑盒(貨號RX303076R)、雌二醇(E2)定量檢測試劑盒(貨號RXJ302812R)、睪酮(T)定量檢測試劑盒(貨號RXJ302700R)均購自泉州市睿信生物科技有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體(貨號ZA-09)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號ZB-2305)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號ZB-2301)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗Akt多克隆抗體(貨號AF6261)、兔抗p-Akt多克隆抗體(貨號AF0016)、兔抗PI3K p85 alpha多克隆抗體(貨號AF6241)、兔抗VEGF多克隆大鼠抗體(貨號AF5131)均購自美國Affinity Biosciences公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(貨號RR047A)購自日本TaKaRa公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)試劑盒(貨號G3322)購自武漢賽維爾生物科技有限公司公司。

1.3 儀器 RT-6100酶標分析儀、RT-3100全自動洗板機均購自美國Rayto公司；EPS300電泳儀、VE-180電泳槽、VE-186轉膜儀均購自上海天能科技有限公司；JW-3021HR高速冷凍離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；Master-S30 UF純水機購自上海和泰儀器有限公司；JS-M6P自動曝光儀購自上海培清科技有限公司；PTC-200普通PCR儀購自美國Bio-Rad公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司；OD1000+超微量分光光度計購自南京五義科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 隨機選取10只大鼠為正常組，其余50只大鼠建立PCOS模型。參照文獻[10]報道，正常組大鼠灌胃1% CMC，造模大鼠灌胃來曲唑1 mg/kg(溶于1% CMC)，每天1次，連續21 d，最后5天進行陰道涂片，灌胃第21天禁食后眼眶后靜脈采血。

2.2 模型驗證 造模最后5 d，每天早上在7：00至8：00收集大鼠陰道分泌物制作陰道涂片，瑞氏染色后在顯微鏡下觀察細胞形態及數量比例。圖1～2顯示，造模大鼠陰道涂片無周期性改變，基本維持在動情間期，顯微鏡下陰道涂片可見大量點狀白細胞及少許片狀角質化細胞；血清T水平較正常組升高(P<0.01)，表明造模成功。

2.3 給藥方法 造模成功后，造模大鼠隨機分為模型組、枸櫞酸氯米芬組(0.45 mg/100 g)及孕育丹糖漿低、中、高劑量組(1.0、2.0、4.0 mL/100 g)，每組10只，而正常組、模型組大鼠灌胃給予生理鹽水1 mL/100 g，各給藥組大鼠灌胃給予相應劑量藥物，連續12 d，給藥最后5 d內每天進行陰道涂片。給藥結束后，進行腹主動脈采血。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清性激素水平 取材前1 d20：00禁食，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，取腹主動脈血5 mL，4 000 r/min離心20 min，取上層血清，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平，酶聯免疫競爭法檢測血清雌二醇(E2)、睪酮(T)水平。

2.5 HE染色觀察大鼠卵巢組織病理學改變 取血后處死大鼠，摘取卵巢組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，制作切片，常規HE染色，在普通光學顯微鏡下觀察卵泡的形態改變并拍照。

2.6 RT-qPCR法檢測大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、VEGFmRNA表達 提取大鼠卵巢組織中總RNA，逆轉錄反應后得到cDNA，采用實時熒光定量PCR技術檢測PI3K、Akt、VEGFmRNA表達，2-△△CT法計算各基因的相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法檢測大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達 取大鼠卵巢組織適量，加入NP-40細胞裂解液(含PMSF)裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清，即得總蛋白，經電泳、轉模、孵育一抗二抗、顯影后，采用Image J軟件測定各蛋白質條帶的吸光度值，以目的蛋白與內參蛋白β-actin的吸光度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.8 免疫熒光組織化學染色檢測卵巢組織中PI3K、Akt、p-Akt 蛋白的表達和定位 取“2.5”項下大鼠卵巢組織切片適量，經常規脫蠟、水化后牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 封閉，滴加兔抗VEGF多克隆抗體(1∶100)，在4 ℃下孵育過夜，次日洗滌后滴加FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶400)，室溫避光孵育50 min，DAPI復染細胞核，漂洗后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，以平均熒光強度為指標進行半定量分析。

3 結果

3.1 陰道涂片檢查 給藥后，正常組大鼠動情周期基本規律；模型組大鼠動情周期紊亂，基本維持在動情間期，顯微鏡下陰道涂片可見大量點狀白細胞及少許片狀角質化細胞；孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠動情周期大部分恢復規律，并呈周期性變化，動情前期可見有核上皮細胞及少量角化細胞；動情期可見大量外形不規則的角化上皮細胞，有少量有核上皮細胞；動情后期可見不規則角化上皮細胞，有核上皮細和白細胞均可見,且比例相當。見圖3。

3.2 孕育丹糖漿對PCOS大鼠血清性激素水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清FSH、LH、T水平升高(P<0.01)，E2水平降低(P<0.01)。與模型組比較，孕育丹糖漿低劑量組FSH、LH、T水平有降低趨勢，E2水平有升高趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)；孕育丹糖漿中劑量組FSH、LH、T水平降低(P<0.05，P<0.01)，E2水平升高(P<0.05)；孕育丹糖漿高劑量組及枸櫞酸氯米芬組FSH、LH、T水平降低(P<0.01)，E2水平升高(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平

3.3 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織病理變化的影響 正常組大鼠卵巢組織形態和細胞結構清晰,可見不同發育階段的卵泡、多個黃體；模型組大鼠卵巢組織可見大小不等的囊腔，卵泡顆粒細胞層數較正常組明顯減少，各級卵泡與黃體稀少；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組大鼠卵巢組織病理變化得到改善，可見各級卵泡及黃體，顆粒細胞層厚度增加且排列整齊，其中高劑量組卵巢改善最明顯；枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織內可見成熟卵泡，體積較大，卵泡液較多，顆粒細胞層厚度增加但排列較紊亂。見圖4。

3.4 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織PI3K、Akt、VEGFmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織PI3K、AktmRNA表達降低(P<0.01)，VEGFmRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織PI3K、AktmRNA表達升高(P<0.01)，VEGFmRNA表達降低(P<0.01)，見圖5。

3.5 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt、VEGF蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達降低(P<0.01)，VEGF蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，VEGF蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，見圖6。

3.6 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢細胞中VEGF表達的影響 正常組大鼠卵巢細胞中VEGF表達較少；與正常組比較，模型組大鼠卵巢細胞中VEGF表達增加，呈現明亮的綠色熒光；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組、枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢細胞中VEGF表達有不同程度的降低，綠色熒光減弱，以枸櫞酸氯米芬組最明顯，見圖7。

4 討論

PCOS以生殖障礙、內分泌異常、代謝紊亂和精神問題為特征,其發病機制尚未闡明[11]。近年來多項研究表明PCOS與PI3K/Akt信號通路密切相關，該通路是調控細胞增殖、抑制細胞凋亡的重要信號通路[12-13]，其與卵巢功能密切相關，尤其影響顆粒細胞的增殖與凋亡、卵母細胞的成熟[14]。顆粒細胞主要為卵母細胞的生長發育提供營養，是卵泡成熟的物質支持細胞[15]。PCOS患者的卵巢病理改變常為顆粒細胞層萎縮變薄，增殖低下[16]。趙帥等[17]認為激活PI3K/Akt信號通路以增強顆粒細胞的增殖能力，降低其凋亡率，有助于改善PCOS排卵障礙。本研究發現，PCOS大鼠卵巢中PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白及基因的表達較正常大鼠降低，且顆粒細胞層菲薄、紊亂；給予孕育丹糖漿治療后，PI3K/Akt通路相關因子表達升高，顆粒細胞層病理損傷明顯修復，說明激活PI3K/Akt信號通路可以上調顆粒細胞的增殖能力，明顯改善卵巢病理改變。與孕育丹糖漿比較，氯米芬的作用效果更佳，但氯米芬存在自身局限性，首先，其本質是抗雌激素藥物[18]，易致宮頸黏液變稠，子宮內膜容受性差，不利于受精及著床；其次，大約15%～40%女性對氯米芬不敏感，出現氯米芬抵抗[19]。前期研究表明，臨床治療PCOS時聯合應用孕育丹糖漿可提高排卵率、妊娠率[20]。

《周易》有云：“天地氤氳，萬物化醇，男女媾精，萬物化生”，說明受孕關鍵在于腎中精氣充盛。腎陰為卵泡發育成熟的物質基礎，腎陽是鼓動卵子排出的動力來源?！半硽杵凇奔础敖涢g排卵期”，為陰陽二氣相接之際，癸水充盛，腎陽充旺，由此可見，腎精充足，陽氣旺盛，重陰轉陽順利，乃可排出卵子。徐志華教授認為PCOS主因臟腑功能失調，其中尤以腎虛為關鍵，治療時以溫補腎陽為主，輔以益陰。孕育丹糖漿由熟地黃、鹽沙苑子、覆盆子、枸杞子、鹽菟絲子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、鹽補骨脂、肉蓯蓉、鎖陽、燙狗脊、當歸組成，共奏溫腎助陽、調補沖任之功。方中重用補腎溫陽之品，同時選用少量滋養腎陰的藥物，溫而不燥，陰陽俱顧。孕育丹糖漿通過補益腎中陰陽，使卵泡成熟化生有源，卵子排出得以鼓動，其補陽之力尤甚，保證了氤氳期重陰轉陽的順利運行。

綜上所述，孕育丹糖漿防治PCOS的機制可能是通過補益腎中陽氣以激活PI3K/Akt信號通路，改善卵巢功能，修復顆粒細胞層損傷，從而提高卵泡質量，增加排卵率，最終達到提高妊娠率的目標。