基于網絡藥理學探討金砂行氣膠囊抗慢性淺表性胃炎的作用機制

張 營， 干國平,2*， 楊桂平， 楊德森,2 ， 余 亮， 陳 倩

(1.湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065；2.湖北省中藥炮制工程技術研究中心，湖北 武漢 430065；3.孝感市中醫醫院，湖北 孝感 432000)

慢性淺表性胃炎屬于慢性胃炎的范疇，是指胃黏膜在各種致病因素作用下所發生的非萎縮性慢性炎癥性病變，約90%胃炎患者屬于該類型[1-3]，患者常表現為反復或持續性上腹不適、飽脹、反酸、噯氣等，本病是慢性胃炎發展的最初階段，如繼續加重，有發展為慢性萎縮性胃炎甚至癌變的可能[4-5]。目前認為，慢性淺表性胃炎的發病多與幽門螺桿菌感染、十二指腸液反流、免疫等因素相關[6-7]，西醫治療手段包括根除幽門螺桿菌、抑酸、保護胃黏膜等，雖有一定療效，但存在容易復發、過敏等問題。

大量研究表明，中醫藥在治療慢性胃炎方面具有一定的優勢。慢性淺表性胃炎屬中醫“胃痛”“痞滿”范疇，其病變部位均在胃[8]，胃黏膜受損，胃失和降而致痞滿、升降失常、氣機不暢而表現為脹滿不適、胃痛，應從脾胃論治。金砂行氣膠囊是孝感市中醫醫院研制的純中藥制劑，主要作用于慢性淺表性胃炎、反流性胃炎、十二指腸球炎等，具有和胃降逆、理氣止痛、消積導滯等功效。為了探究金砂行氣膠囊治療慢性淺表性胃炎的藥理作用及其機制，本研究借助網絡藥理學來揭示該制劑作用機制，為后續研究提供新的思路及方向。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD大鼠，體質量160～180 g，雌雄各半，購于湖北省三峽大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK(鄂)2017-0012。

1.2 試劑與藥物 金砂行氣膠囊(組方藥材柴胡、郁金、青皮、香附、黃連、法半夏、雞內金、砂仁、焦山楂、降香、萊菔子)由孝感市中醫醫院提供。氣滯胃痛顆粒(批號20191226)，購自遼寧華潤本溪三藥有限公司；阿莫西林膠囊(批號200644)，購自海南通用三洋藥業有限公司；克拉霉素膠囊(批號2001008)，購自江蘇亞邦愛普森藥業有限公司；奧美拉唑腸溶膠囊(批號JA2004001)，購自浙江金華康恩貝生物制藥有限公司；膠體果膠鉍劑膠囊(批號20191103)，購自山西振東安特生物制藥有限公司。羧甲基纖維素鈉(批號20120330)、氨水(批號20200529)，購自國藥集團化學試劑有限公司；4%多聚甲醛(批號HT202201)，購自武漢塞維爾生物科技有限公司。PierceTM Rapid Gold BCA 蛋白測試盒、TNF-α試劑盒、 IL-6 ELISA 試劑盒(貨號E-BC-K318-M、E-EL-R2856c、E-EL-R27842c)，購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；5×蛋白上樣緩沖液，購自四維加生物科技(武漢)有限公司；Tris緩沖液，購自德國BioFroxx公司。

1.3 儀器 RM2235石蠟切片機(德國Leica公司)；IX70光學顯微鏡(日本Olympus公司)；高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)；多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 模型建立 60只大鼠隨機分為正常組8只、造模組52只，造模組大鼠每天自由飲用0.05%氨水，同時配合饑飽失常復制慢性淺表性胃炎模型。造模80 d后，隨機抽取2組大鼠進行胃組織病理學檢測，根據慢性淺表性胃炎胃組織的病理改變判定模型是否建立成功[9-10]。

2.2 分組及給藥 稱取膠囊內容物適量，溶于1% CMC-Na中，超聲溶解30 min，即得藥液。將大鼠隨機分為正常組，模型組，金砂行氣膠囊低、中、高劑量組(187.5、375、750 mg/kg)，氣滯胃痛顆粒組(782 mg/kg)，四聯療法組(阿莫西林、克拉霉素、奧美拉唑腸、膠體果膠鉍聯合用藥，劑量分別為20.82、5.21、0.42、2.08 mg/kg)，每組8只，給藥組大鼠每天灌胃給予相應藥物，正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積1% CMC-Na混懸液，連續給藥30 d。

2.3 取材 取材前夜大鼠禁食不禁水，當天(給藥第30天)稱定體質量后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.1 mL/kg)麻醉，采用一次性采血針腹主動脈采血于真空采血管中，血樣室溫靜置60 min后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存。大鼠取血后處死，迅速取胃組織，沿胃大彎側切開，生理鹽水沖洗后濾紙吸干，切取部分胃組織，置于4%多聚甲醛中固定，其余放入消毒處理過的凍存管中，立即置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 HE染色觀察大鼠胃組織病理變化 將已固定的大鼠胃組織采用石蠟包埋法制片，HE染色后在高倍顯微鏡下觀察，拍照記錄病理切片的形態變化。

2.5 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平 酶標儀讀取光密度(OD)值，根據標準曲線計算TNF-α、IL-6水平。

2.6 Western blot法檢測大鼠胃組織中p-IκBα、p-Akt1蛋白表達 取大鼠胃組織適量，加入組織蛋白提取試劑，在冰浴中勻漿裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清，即得總蛋白樣本。蛋白樣本加入5×蛋白上樣緩沖溶液，100 ℃水浴煮沸10 min進行變性處理，經電泳、轉膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗置于搖床上，在4 ℃下孵育過夜，次日TBST洗膜，加入二抗置于搖床上，在4 ℃下孵育1 h，滴加ECL發光液進行顯影。采用Odyssey成像系統進行掃膜，通過Odyssey v2.0軟件進行分析。

2.7 金砂行氣膠囊成分和靶點數據庫的構建 應用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，得到金砂行氣膠囊的活性成分，并檢索其活性成分的作用靶點，Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數據庫對檢索到的藥物靶點進行基因名校正。以“chronic superficial gastritis”為關鍵詞，在OMIM(https://www.omim.org/)和Genecards(https：//www.genecards.org/)數據庫中檢索與慢性淺表性胃炎相關的靶點，刪除重復靶點。于Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)上分別錄入金砂行氣膠囊和慢性淺表性胃炎的靶點，繪制韋恩圖，得到兩者交集，作為潛在作用靶點，最后上傳至在線STRING軟件，設置參數為>0.9，最后輸出PPI蛋白互作網絡圖，獲取蛋白互作信息。

2.8 金砂行氣膠囊成分靶點交互作用和機制研究 采用Cytoscape3.6.1軟件，構建金砂行氣膠囊“成分-靶點-疾病”交互作用網絡圖，“Network Analysis”功能進行網絡拓撲分析，依據度值篩選分析關鍵化合物。通過DAVID數據庫對交集作用靶點進行GO分析和KEGG通路富集分析，預測金砂行氣膠囊作用于慢性淺表性胃炎的分子作用機制。

3 結果

3.1 藥理作用研究

3.1.1 模型評價 在第30～80天，造模組大鼠體質量增長緩慢，同一時間點低于正常組(P<0.05,P<0.01)，見表1。正常組大鼠胃組織黏膜腺管排列整齊，大小形狀一致，腺體排列緊密整齊；造模組大鼠在80 d時，胃黏膜層炎性細胞浸潤，程度以中重度為主，胃腺管紊亂或疏密不均，黏膜層呈充血性水腫等炎性損傷表現，見圖1。依照我國慢性胃炎病理診斷標準(2006，上海)和悉尼直觀模擬評分法，評定模型建立成功。

表1 造模期間大鼠體質量變化

3.1.2 金砂行氣膠囊對慢性淺表性胃炎大鼠體質量的影響 如表2所示，與模型組比較，給藥15 d后，金砂行氣膠囊低、中劑量組大鼠體質量有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05)，金砂行氣膠囊高劑量組、四聯療法組大鼠體質量均增加(P<0.05)；給藥30 d后，金砂行氣膠囊中、高劑量組大鼠體質量有較大幅度增長，但差異仍無統計學意義(P>0.05)。

3.1.3 金砂行氣膠囊對慢性淺表性胃炎大鼠胃組織病理學變化的影響 如圖2所示，正常組大鼠胃黏膜腺管排列整齊，大小形狀一致，腺體排列緊密整齊，壁細胞、主細胞界限清楚，固有層內未見炎性細胞浸潤，黏膜下層無或稍輕微水腫；模型組大鼠胃腺管紊亂或疏密不均，黏膜層呈充血性水腫，可見上皮細胞壞死脫落，黏膜下層水腫，程度以中、輕度為主；金砂行氣膠囊給藥30 d后，大鼠胃黏膜固有層炎性細胞數目減少，胃腺排列稍整齊平整且腺管構造逐漸規則，接近正常組。由此表明，金砂行氣膠囊對慢性淺表性胃炎的胃組織病理改變有顯著抑制作用。

表2 各組大鼠體質量變化

3.1.4 金砂行氣膠囊對慢性淺表性胃炎大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.01)；與模型組比較，四聯療法組和金砂行氣膠囊各劑量組大鼠血清TNF-α水平均降低(P<0.05，P<0.01)，氣滯胃痛顆粒組、四聯療法組和金砂行氣膠囊高、中劑量組大鼠血清IL-6水平均降低(P<0.05，P<0.01)。

3.1.5 金砂行氣膠囊對慢性淺表性胃炎大鼠胃組織p-IκBα、p-Akt1蛋白表達的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組大鼠胃組織p-IκBα、p-Akt1蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，氣滯胃痛顆粒組和金砂行氣膠囊中、高劑量組大鼠胃組織p-IκBα蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，氣滯胃痛顆粒組、四聯療法組和金砂行氣膠囊中、高劑量組大鼠胃組織p-Akt1蛋白表達降低(P<0.05)。

3.2 網絡藥理學研究

3.2.1 成分和靶點的篩選 在TCMSP數據庫中，分別檢索砂仁、半夏、黃連、柴胡、降香等11味中藥，刪除無作用靶點和重復的化合物，共有123個，對應2 071個靶點，刪除重復靶點，最終得到457個。以“慢性淺表性胃炎”為關鍵詞進行檢索，在OMIM和Genecards數據庫中搜索相關靶點，合并刪除重復靶點，最終得到疾病靶點730個。將上述2種靶點進行交集，發現有126個靶點重合，見圖5。

3.2.2 核心靶點蛋白相互作用網絡構建 將126個共同作用靶點導入STRING數據庫中，繪制相關靶點PPI網絡圖，見圖6，設置置信度為0.9并隱藏斷開單獨靶點，PPI圖中有90個節點，447條邊，平均節點度9.93，PPI的富集顯著性P<1.0×10-16。節點代表藥物治療慢性淺表性胃炎的作用靶點，邊代表靶點與靶點之間有相互作用，表明這些靶點在某些方面是相互關聯，協同配合起到治療疾病的作用。導出含節點信息的TSV文件，在Cytoscape中分析節點信息，篩選出前20個核心調控基因靶點，見表3。

表3 金砂行氣膠囊關鍵靶點基因的拓撲學分析

3.2.3 “成分-靶點-疾病”網絡圖構建 采用Cytoscape 3.6.1軟件，構建“成分-靶點-疾病”相互作用網絡，見圖7，圖中紅色圓形代表金砂行氣膠囊中活性成分，綠色三角形代表蛋白靶點。再進行網絡拓撲屬性分析，依據度值大小篩選得到排名前15的潛在重要活性成分，分別為槲皮素、山柰酚、木犀草素、熊果酸、金絲桃苷、β-谷甾醇、右旋巴馬汀、維斯體素、刺芒柄花素、柚皮素、異鼠李素、川陳皮素、豆甾醇、美迪紫檀素、卡維丁。

3.2.4 生物過程與通路分析 生物過程分析主要涉及藥物反應、老化基因的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、NF-κB轉錄因子活性的正調控及凋亡過程的正向調控等；在細胞組成和分子功能方面，主要集中在細胞胞外間隙、胞漿和線粒體外膜中，并涉及酶結合、蛋白質結合、細胞因子活性、蛋白激酶活性等，見圖8A。對126個關鍵靶點進行KEGG信號通路分析，共得到165條信號通路(P<0.05)，選取排名前二十的繪制氣泡圖，進行可視化分析，見圖8B，可知共同靶點主要富集于癌癥通路、腫瘤壞死因子、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等。

4 討論

本研究通過網絡藥理學方法，得到藥物-疾病共同靶點126個，金砂行氣膠囊可作用于多個靶點，靶點之間也存在著復雜的相互作用關系，并且富集于多條炎癥相關的信號通路，體現了中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點。富集分析顯示核心靶點主要作用TNF、TP53、Akt1、MAPK等通路上，提示這些蛋白是金砂行氣膠囊作用于炎癥通路的主要分子。其中IL-6的表達與炎癥反應程度、幽門螺旋桿菌相關胃腸病發展風險相關，不僅可以引起炎癥細胞的集中，還能刺激更多炎癥介質的產生[11-12]。MAPK8作為一種激酶，當機體發生炎癥反應時，能夠誘導細胞發生凋亡，同時促進炎癥因子TNF-α、IL-1β的活化，加重慢性淺表性胃炎的炎癥損傷[13-14]。caspase3與慢性淺表性胃炎的發病關系密切，該基因低表達導致的細胞凋亡異常降低可能是胃癌的發病機制之一[15]。TNF-α是促進幽門螺旋桿菌感染、抑制胃酸分泌的關鍵性炎癥因子[16]，其能夠誘導NF-κB結合雄激素受體啟動子，激活炎癥信號通路，使IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子水平升高，結合富集分析推測TNF信號通路的激活是慢性淺表性胃炎發生發展的重要因素，調控TNF信號通路可抑制幽門螺旋桿菌感染[17-18]，從而控制該病的進展，可能成為該病新的治療方向。

綜上所述，金砂行氣膠囊可有效改善慢性淺表性胃炎模型大鼠癥狀。網絡藥理學表明金砂行氣膠囊是通過多成分、多靶點、多通路協同發揮抗慢性淺表性胃炎藥理作用，為進一步分子作用機制研究提供了理論依據。