銀杏酮酯洗脫工段近紅外光譜通用模型的建立

趙林松， 江美芳， 王丹丹， 韋亞芳， 高 崎*

(1.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203；2.上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司，上海 201703)

銀杏酮酯為我國自主研發的一種新型銀杏葉提取物，是銀杏葉主要有效成分(銀杏內酯和銀杏黃酮)高度富集的提取物，具有擴張冠狀動脈、抑制血小板聚集的作用，主要用于治療血瘀誘發的胸痹及血瘀引起的眩暈，還對冠心病、心絞痛有一定療效[1]。在工業生產中，需要利用柱層析技術來富集銀杏葉提取液中藥效成分，同時去除雜質和致敏成分(銀杏酸)[2]，這也是關鍵工段。

目前，藥品質量控制僅依賴于對成品的檢驗，往往忽視了生產過程中有效成分的變化情況，但傳統檢測技術一般需要復雜的樣品處理，并且耗時較長，難以滿足洗脫過程的動態檢測[3-4]。同時，在工廠中判斷洗脫的結束主要來自工人主觀經驗，沒有科學的數據支持，造成產品均一性較差、資源浪費等問題。

近紅外光譜具有無需樣品預處理、無損耗、檢測速度快等特點，已作為一種成熟的快速分析技術廣泛應用于食品、材料等領域[5-8]。因此，本實驗采用該技術構建銀杏酮酯生產工藝洗脫工段大孔樹脂的洗脫1過程和聚酰胺樹脂的洗脫2過程(圖1)中總萜類內酯定量獨立模型,并且在此基礎上建立了這2個工段的通用模型，以期實現整體洗脫工段總萜類內酯的快速定量分析，提升檢測效率[9]，為銀杏酮酯洗脫過程提供快速無損的檢測方法，同時為洗脫終點判定提供數據支持，從而實現生產過程質量控制，保證產品質量[10]。

1 材料

MPA-II近紅外光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司)，Waters Xevo G2-XS Q-TOF·ESI 液質聯用儀(美國Waters公司)；OPUS7.8、MATLAB R2017a化學計量學軟件；Oringin2018繪圖軟件。洗脫液收集自上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司提取車間的大孔樹脂柱和聚酰胺柱，取樣方式為洗脫開始前15 min每隔3 min取樣1次，15 min后至洗脫60 min每隔5 min取樣1次，最后每隔10 min取樣1次直至洗脫結束，得7批大孔樹脂柱洗脫1，批號分別為201012、201022、201104、201105、201118、201119、201128，共132份樣品；7批聚酰胺柱洗脫2，批號分別為201012、201022、201104、201105、201118、201119、201128，共124份樣品。

2 方法

2.1 近紅外光譜 空白背景為空氣；分辨率8 cm-1；樣品池為2 mm石英比色皿；每個樣品圖譜掃描32次；波數12 000～4 000 cm-1，原始光譜見圖2。

2.2 UPLC-MS法測定總萜類內酯含量

2.2.1 分析條件

2.2.1.1 色譜 Waters Acquity UPLC/Xevo G2-XS Q-TOF超高效液相色譜質譜聯用儀；Waters Acquity UPLC BEH C181.7 μm色譜柱 (100 mm×2.1 mm)；流動相水(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～25%B；5～17 min，25%B；17～22 min，25%～35%B；22～35 min，35%～40%B；35～40 min，40%～65%B；40～50 min，65%～85%B；50～60 min，85%～98%B)；體積流量0.2 mL/min；柱溫45 ℃；進樣量1 μL。

2.2.1.2 質譜 負離子模式，Sensitivity模式(分辨率30 000)；毛細管電壓-2.5 kV；樣品錐孔電壓40 V；源偏移電壓80 V；源溫120 ℃；脫溶劑溫度450 ℃；錐孔氣體積流量50 L/h；脫溶劑氣體積流量800 L/h；霧化氣壓力6.0 bar(1 bar=100 kPa)；m/z50～100 0；校正溶液0.5 mmol/L甲酸鈉溶液，體積流量20 μL/min；實時校正lock spray為1 ng/μL亮氨酸腦啡肽溶液，m/z554.261 5。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、白果內酯對照品適量，二甲基亞砜制成各成分質量濃度約為1 mg/mL的溶液，50%乙醇稀釋，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 將每個批次收集的0～10、10～30、30 min至洗脫結束的樣品分別用50%的乙醇稀釋500、250、50倍，即得。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液適量，50%乙醇稀釋成系列質量濃度，在“2.2.1”項條件下各進樣1 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標 (Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.2.1”項條件下進樣測定6次，測得各成分峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取洗脫液適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

表1 各成分線性關系

2.2.7 穩定性試驗 取洗脫液適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.2.1”項條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD均小于3%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取各成分含量已知的洗脫液1 ml，加入低、中、高質量濃度對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果(n=3)

2.3 近紅外光譜模型建立 采用偏最小二乘回歸(PLSR)，通過留一交互驗證法對光譜數據和實測化學值進行擬合建模。基于間隔偏最小二乘法(iPLS)、協同間隔偏最小二乘(SiPLS)、競爭自適應加權采樣法(CARS)等變量篩選方法選擇波段變量，以交互驗證誤差均方根(RMSECV)、相關系數(R)為評價指標確定最佳波段選擇方法，以性能偏差比(RPD)、驗證集預測誤差均方根(RMSEP)、預測相對偏差(RSEP)為評價指標確定最佳光譜預處理方法。其中，R越接近1，表示模型預測值與標準對照方法分析值之間的相關性越好；RPD越大，表明模型性能越好，其數值>3時表明模型具有較高的預測精度[11]；RMSEP與樣品化學值相關，其數值越小，結果越準確；RSEP表示驗證集的預測值與真實值之間整體誤差，其數值越小，模型預測的準確度越高，但上述參數不能單獨作為參考，需綜合應用來考察模型性能。在中藥研究體系中，當RPD>3、RSEP<15%時，模型性能和準確度能滿足實際應用[12]。

3 結果

3.1 樣品劃分 采用Kennard-Stone選擇方法，將2種樣本以7∶3的比例劃分為校正集和驗證集，驗證集作為獨立的樣本，僅用于模型驗證；通用模型的校正集則為兩種洗脫液校正集的總和，驗證集為兩種洗脫液的驗證集總和，結果見表3。由此可知，各模型驗證集濃度范圍均在校正集濃度范圍內。

表3 樣品劃分結果

3.2 特征變量篩選

3.2.1 iPLS法 iPLS法是一種波段區間選擇方法。本實驗將整個光譜等分成10個等寬子區間，每個子區間上進行PLS回歸，找出最小的RMSECV對應區間，再以其為中心單向或雙向消減(或擴充)波段變量，得到最佳單個子區間[13]。

3.2.2 SiPLS法 SiPLS是基于iPLS算法發展而來的波段選擇方法，將全波段劃分為若干個區間，將不同波段區間個數的任意組合。本實驗將整個光譜等分成10個等寬的子區間并任意組合，通過增加與去掉子區域來尋找到R最大、RMSECV最小的波段區間組合，作為最佳波段變量[14]。

3.2.3 CARS法 CARS是一種利用回歸系數進行變量篩選的方法，基于“適者生存”原則，剔除無關變量，減少共線變量的影響。本實驗通過自適應加權采樣技術篩選出PLS模型中回歸系數絕對值大的波段點，去掉權重較小者，利用交互驗證選出模型的RMSECV至最低的子集[15]，篩選過程見圖3。

3.2.4 波段篩選 表4顯示，洗脫1、洗脫2、通用模型的最佳波段選擇方法分別為iPLS、SiPLS、SiPLS。圖4顯示，上述3種模型分別在6 100～5 772 cm-1，8 252～7 500、6 100～5 448 cm-1，9 400～7 500 cm-1波數處有最大R、RPD和最小的RMSECV。銀杏內酯屬于萜類化合物，在近紅外光譜中最重要的吸收峰來自C-H和O-H，但洗脫液中溶劑主要為水和乙醇的混合物，故本實驗波段避開了5 180、6 900 cm-1附近水(H2O)的干擾[16]，主要來自6 020～5 550、8700～7 040 cm-1處的CH2、CH3倍頻合頻吸收，其中通用模型可最大程度保留有效波段區間，與成分結構之間具有較高的相關性，并且排除了近紅外光譜冗余信息，盡量保留了有效變量。

表4 特征波段選擇方法

3.3 光譜預處理 在波段篩選的基礎上，本實驗考察了二階導數、減去1條直線、矢量歸一化(SNV)、一階導數及與多種預處理方法的聯合應用，并以RMSEP、RPD、RSEP為參考值進行篩選，結果見表5。

表5 光譜預處理方法

由此可知，當洗脫1、洗脫2、通用模型的最佳光譜預處理方法分別為一階導數結合減去1條直線、二階導數、二階導數時，各模型RPD、RMSEP、RSEP最理想。另外，經光譜預處理后波段所建立模型的性能和準確度都得到一定提升，可有效過濾近紅外光譜中噪聲信息，提高模型穩健性。

3.4 定量預測模型建立 模型見表6，預測值與實測值的相關性分析見圖5。

表6 各模型參數

3.5 模型驗證 將洗脫1、洗脫2、通用模型的實測值和預測值進行t檢驗，測得P值分別為0.867、0.943、0.823，表明兩者之間無顯著差異，并且三者R均大于0.95，RPD均大于3，RSEP均小于15%，表明其相關性良好，性能優異，準確性較高，可滿足實際應用。洗脫1、2過程中總萜類內酯含量分別為0.021～2.952、0.084～4.102 mg/mL，表明上述2個過程中有一部分樣本存在重疊，故通用模型具有更大的總萜內酯的濃度覆蓋范圍。

再計算通用模型中洗脫1、2驗證集各自的RSEP，與獨立模型進行比較，結果見表7。由此可知，在洗脫1過程中通用模型提高了預測準確度，而在洗脫2過程中預測準確度雖然略低，但整體上仍在可接受范圍內。因此，基于相同成分的光譜變量所建立的通用模型能適用于2個洗脫過程，在增加樣本量的同時擴大了模型應用范圍，從而大幅度提高了模型對總萜類內酯的檢測效率。

4 討論與結論

本實驗收集銀杏酮酯工業生產2個洗脫過程中的樣品，采用LC-MS法檢測洗脫液中萜類內酯含量，結合NIRs技術建立了洗脫1、洗脫2及2個過程的通用定量預測模型，發現三者均有較高的性能和準確性，能滿足定量分析，可用于快速檢測。

表7 獨立模型與通用模型的比較

同時，2個獨立的洗脫過程模型檢測指標一致，但處于不同的過程，有一定差異，故通用模型擴大了建模樣本的數量和濃度范圍，增加了模型可靠性和魯棒性，同時相比于洗脫1模型，它具有更好的性能和準確性；相比于獨立模型，它可顯著提高模型預測效率。

綜上所述，本實驗證明了通用模型在銀杏內酯類成分洗脫過程定量分析中的可行性。今后，可通過模型傳遞將通用模型應用到近紅外的在線設備上，同時在考察工廠產能的基礎上確定洗脫終點的最佳范圍，實現對洗脫過程的在線監控和自動化，最終達到中間品的快速放行和提升產品的均一性。