芹菜素納米結構脂質載體的制備及其體內抗腫瘤活性研究

王風云， 李偉宏

(河南應用技術職業學院，河南 鄭州 450042)

芹菜素屬于黃酮類化合物，也稱芹黃素，主要存在于柏科圓柏葉、卷柏科卷柏全草及傘形科植物旱芹葉中[1]，具有多種活性，主要包括抗炎、抗氧化、抗動脈硬化、抗血栓、抗病毒、抗焦慮等[2]，并且近年來其抗腫瘤作用也日益得到關注[3-5]，尤其是在抗乳腺癌方面最顯著，其機制可能是通過增加Bax/Bcl-2比值、下調突變型p53基因表達、上調P73介導PIG3基因表達等來抑制腫瘤細胞生長[5]，但該成分為難溶性物質[6]，難以制成注射劑。納米技術是難溶性藥物制成注射劑的有效途徑[7]，往往可增強中藥有效成分的抗腫瘤活性，已報道的芹菜素相關研究有固體脂質納米粒[1]、PLGA納米粒[8]、膠束[9]等，但存在包封率和載藥量不高、穩定性差等缺陷。

納米結構脂質載體將固液脂質聯合使用，具有較高的包封率及載藥量[10-13]，穩定性良好，能有效改善難溶性藥物的溶解性、藥效等[14-15]。本實驗制備芹菜素納米結構脂質載體，并考察其體內抗腫瘤活性，以期為該成分提供可靜脈注射的劑型，豐富其抗腫瘤活性研究，也為相關臨床應用奠定基礎。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(配置二極管陣列檢測器，美國Agilent公司)；MSA6.6S型電子分析天平(百萬分之一，上海精密儀器儀表有限公司)；TMX-22R型高速離心機(美國貝克曼-庫爾特公司)；PRD-S-027HDHT型超聲波清洗儀(深圳市普瑞登科技有限公司)；Master-sizer型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；ELx808型酶標儀(山東浩中化工科技有限公司)；HSX-1000N恒溫恒濕培養箱(上海幕斯實驗設備有限公司)；超濾離心管(30 kDa，美國Millipore公司)。

紫杉醇注射液(批號200518，北京協和藥廠)。芹菜素原料藥(批號200218，純度98.6%，陜西惠科植物開發有限公司)。Miglyol?812(批號P20191205，北京鳳禮精求醫藥股份有限公司)；單硬脂酸甘油酯(批號161025，北京鳳禮精求醫藥股份有限公司)；泊洛沙姆188(批號20201105，武漢新大地環保材料股份有限公司)。

人乳腺癌MDA-MB-231細胞，購自河南省腫瘤研究所。

SPF級雌性裸鼠，6～7周齡，體質量20～24 g，購自河南省動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK(豫)2016-0001。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定芹菜素含量

2.1.1 色譜條件 Agilent SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸-乙腈(30∶70，超聲混勻后單泵進樣)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長312 nm。

2.1.2 線性關系考察 稱取芹菜素對照品50 mg至50 mL量瓶中，30 mL甲醇超聲處理3 min，靜置10 min后甲醇定容，得1.0 mg/mL貯備液，流動相依次稀釋成50.0、25.0、10.0、1.0、0.5、0.05 μg/mL溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質量濃度(X)進行回歸，得方程為Y=18.712 5X+0.843 2(r=0.999 9)，在0.05～5.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取納米結構脂質載體混懸液1 mL，置于50 mL量瓶中，30 mL甲醇超聲處理3 min，流動相定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 方法學考察 取納米結構脂質載體混懸液適量，按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得芹菜素含量RSD為1.32%，表明該方法重復性良好。取同一份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得芹菜素含量RSD為0.71%，表明儀器精密度良好。取同一份供試品溶液，于0、1、2、4、8、12 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得芹菜素含量RSD為0.85%，表明溶液在12 h內穩定性良好。取9份納米結構脂質載體混懸液，每份1.0 mL，置于50 mL量瓶中，分為低、中、高3組，每組3份，分別加入對照品溶液0.6、0.8、1.0 mL，30 mL甲醇超聲處理3 min，流動相定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得芹菜素平均加樣回收率分別為99.37%、100.13%、99.69%，RSD分別為0.44%、0.72%、0.50%。

2.2 納米結構脂質載體制備 固定芹菜素用量為50 mg，固態脂質材料為單硬脂酸甘油酯，液態脂質材料為Miglyol?812，加入20 mL無水乙醇，75 ℃水浴攪拌溶解，作為有機相；固定水相體積為60 mL，加入一定量泊洛沙姆188，75 ℃水浴攪拌溶解，作為水相，在800 r/min下將有機相滴至水相中，滴畢后敞口攪拌1.5 h，在300 W功率下超聲處理15 min(工作2 s，間隔2 s)，置于-15 ℃冰箱中低溫固化10 min，室溫靜置20 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，補加蒸餾水至60 mL，搖勻，即得。

2.3 包封率、載藥量測定 取納米結構脂質載體混懸液1 mL，置于50 mL量瓶中，30 mL甲醇超聲處理3 min，流動相定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算芹菜素總含量(m總)。取1 mL納米結構脂質載體混懸液至超濾管中，12 000 r/min離心30 min，取外管續濾液，計算游離芹菜素含量(m游離)，按照文獻[12]報道的方法測定包封率、載藥量。

2.4 粒徑、Zeta電位測定 取0.1 mL納米結構脂質載體混懸液，加入3.5 mL蒸餾水混勻，轉移至比色皿中，測定粒徑、Zeta電位。

2.5 Box-Behnken響應面法 對納米結構脂質體而言，包封率、粒徑是重要指標[9]。課題組前期考察大豆油、Miglyol?812、油酸，發現以Miglyol?812制備時包封率、粒徑均優于大豆油、油酸，故選擇其作為液態脂質。不同固液脂質比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)對包封率有一定影響，而對粒徑影響更大，由于1∶1時初乳有分層現象，5∶1時包封率較低，故對2∶1、3∶1、4∶1進行優化。不同脂藥比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)對包封率、粒徑有一定影響，由于25∶1時包封率不再增加，粒徑開始增大，故對10∶1、15∶1、20∶1進行優化。不同表面活性劑用量(0.5%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)對包封率、粒徑的影響較大，由于0.5%時粒徑較大，包封率較低，1.8%時包封率出現下降趨勢，故對0.8%、1.2%、1.6%進行優化。再對超聲功率(200、250、300、350 W)、超聲時間(5、10、15、20 min)進行考察，最終確定兩者分別為300 W、15 min。

在上述預實驗基礎上，選擇脂藥比(X1)、固液脂質比(X2)、表面活性劑用量(X3)作為影響因素，包封率(Y1)、粒徑(Y2)作為評價指標，采用Box-Behnken響應面法優化制備工藝，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

表3 Y1方差分析

表4 Y2方差分析

響應面分析見圖1～2。由圖1可知，固定X3時隨著X1或X2增加，包封率先升后降，以X1影響程度更明顯；固定X1時X2與X3交互作用較明顯，包封率隨著X2或X3增加有降低趨勢；固定X2時包封率隨著X1增加先升后降。由圖2可知，X1X2、X1X3、X2X3曲面均較陡峭，表明兩者交互作用明顯，隨著其中2個因素同時減小，粒徑均呈先降低后略微升高的趨勢。最終確定，最優工藝為脂藥比14.3∶1，固液脂質比3.8∶1，表面活性劑用量1.3%，包封率為84.54%，粒徑為162.4 nm。按上述優化工藝平行制備3份納米結構脂質載體，測得平均包封率為82.87%，粒徑(圖3)為164.8 nm，與預測值84.54%、162.4 nm接近，表明該工藝穩定可行。

2.6 載藥量、Zeta電位測定及形態觀察 取“2.5.4”項下3批納米結構脂質載體，按“2.3”項下方法測得平均載藥量為5.13%，按“2.4”項下方法測得平均Zeta電位(圖4)為-33.5 mV。

取納米結構脂質載體混懸液0.1 mL，加入3 mL蒸餾水混勻，滴在銅網上，靜置0.5 h后滴加0.5%鎢酸鈉溶液，靜置10 min染色，濾紙輕輕吸去多余液體，在透射電鏡(TEM)下觀察，結果見圖5。由此可知，納米結構脂質載體呈球形或橢圓形，基本無粘連。

2.7 體外釋藥研究 設定溶出儀溫度為(37±1)℃，攪拌槳轉速為75 r/min，釋放介質為2%SDS溶液，體積為1 000 mL。剪取5 cm透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)，活化后備用。取納米結構脂質載體混懸液(芹菜素含量為2 mg)適量，加入3 mL釋放介質，轉移至透析袋，兩端扎緊，再制備芹菜素乙醇溶液及2%SDS混懸液，同法操作，于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36、48、72 h各取樣3 mL，同時補加3 mL空白釋放介質，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測定累積釋放度，結果見圖6。由此可知，乙醇溶液在6 h內基本釋放完全，透析袋基本不吸附該成分；2%SDS混懸液12 h內累積釋放度為35.17%，但72 h內僅增加至38.63%；納米結構脂質載體在前6 h釋藥相對較快，累積釋放度為51.32%，之后進入明顯的緩慢釋藥階段，72 h內累積釋放度為79.08%。

2.8 介質穩定性研究 取納米結構脂質載體混懸液適量，分別與1.8%NaCl溶液、10%葡萄糖溶液等體積混合，或與空白血漿按1∶4比例混合，置于37 ℃水浴中，于0、4、8、12、16、20、24 h測定粒徑，結果見圖7。由此可知，加入1.8%NaCl溶液、10%葡萄糖溶液或空白血漿后粒徑均有增加趨勢，但在1.8%NaCl溶液中程度最小，故選擇其作為注射介質。

2.9 體內抗腫瘤活性研究

2.9.1 模型建立 取對數生長期的MDA-MB-231細胞，生理鹽水重懸其密度至2.5×107/mL，接種前將細胞懸液搖勻以保證腫瘤呈圓形或類圓形。將細胞懸液振蕩后，于超凈工作臺上按0.2 mL/只劑量接種于裸鼠背部右側靠近腋窩處皮下，輕壓注射點以防止細胞外滲，全程在SPF級實驗環境中進行。

2.9.2 分組、給藥與指標檢測 將荷瘤裸鼠隨機分為空白組、陽性組(5 mg/kg紫杉醇)及芹菜素納米結構脂質載體低劑量組(2 mg/kg)、中劑量組(5 mg/kg)、高劑量組(10 mg/kg)，每組8只，每2 d天腹腔注射給藥1次，連續3周。每3 d測量腫瘤短徑(a)、長徑(b)，計算瘤體積V[16]，公式為V=ab2π/6，選擇大于100 mm3者進行后續研究。實驗結束后稱定瘤重，頸椎脫臼處死裸鼠，剝離瘤體，計算抑瘤率，公式為抑瘤率=(1-給藥組平均瘤重/空白組平均瘤重)×100%[16-17]。

2.9.3 結果分析 各組裸鼠均未出現死亡現象，并且體質量變化程度均未超過15%(增重分別為13.7%、9.6%、3.2%、-4.7%、-12.9%)，一般認為在治療期間動物死亡超過20%或體質量下降超過15%時均為藥物毒性反應[18]，可知本實驗所用藥物劑量基本不產生毒性。圖8～9、表5顯示，各組裸鼠瘤體積由大到小依次為空白組、芹菜素納米結構脂質載體低劑量組、芹菜素納米結構脂質載體中劑量組、芹菜素納米結構脂質載體高劑量組、陽性組；與空白組比較，陽性組及芹菜素納米結構脂質載體中、高劑量組裸鼠瘤重降低(P<0.01)，表明抑瘤作用顯著，其中高劑量組降低程度與陽性組無明顯差異(P>0.05)，抑瘤率大于30%，具有較好的開發潛力，并且2組裸鼠體質量比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明高劑量芹菜素納米結構脂質載體毒性可能低于紫杉醇。

3 討論

芹菜素在水中溶解度僅為1.35 μg/mL[6]，不具備直接制成注射劑的條件[16]，故本實驗采用納米技術將該成分制成納米結構脂質載體，并采用Box-Behnken響應面法優化處方。體外釋藥研究結果顯示，初期(0～6 h)釋藥較快，可能是由于納米結構脂質載體中存在一定量的游離芹菜素，也可能與吸附在納米結構脂質載體淺表層、表層的藥物容易釋放有關；后期(6 h后)釋藥較慢，可能是由于固液脂質載體對包裹于內部的藥物有阻滯作用所致[15]。

表5 各組裸鼠抑瘤率比較

正常組織細胞間距一般在50 nm左右，而腫瘤細胞由于生長速度較快，導致其細胞間距也較大，一般在100～250 nm之間[17]，故200 nm左右粒徑的納米制劑可選擇性進入腫瘤組織而發揮抗腫瘤作用，提高藥效，同時其緩釋作用也有助于藥物持續發揮藥效[7,19]。芹菜素體內穩定性存在一定問題[20]，而采用固體脂質體包裹后有助于改善其穩定性，提高藥效。體內抗腫瘤研究結果表明，納米結構脂質載體高劑量組(10 mg/kg)的腫瘤抑制率超過30%，基本達到紫杉醇(5 mg/kg)水平。本實驗解決了芹菜素制備注射劑的難題，而且證明了其體內有效性，后續將對該成分體內藥動學、凍干制劑工藝、質量標準等方面作進一步研究。