輻照對紅景天提取物活性成分及降血糖作用的影響

曲 孟 常艷秋 齊 欣 崔承弼,

(1. 延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002)

糖尿病已經成為了世界范圍內威脅人類健康的主要慢性病之一[1]，其中1型糖尿病多發于兒童和青少年[2]，發病原因主要是機體內胰島β細胞受損，喪失合成胰島素的功能，最終引發糖代謝紊亂，使血糖水平居高不下[3]。糖尿病患者需終身注射(服用)胰島素藥物并面對因此帶來的不良反應[4]。

紅景天(RhodiolaroseaL.)系景天科多年生草本或亞灌木植物[5]，從紅景天根部提取出的活性物質主要成分為紅景天苷、酪醇、絡塞維、槲皮素、肉桂醇、多糖等，其中紅景天苷和酪醇是紅景天質量的評價指標，而絡塞維是紅景天的特有成分[6]。紅景天的活性成分具有抗炎[7]、肝保護[8]、抗氧化[9]、抗疲勞[10]、抗衰老[11]等功效。有研究[12]表明，紅景天中的活性成分紅景天苷可通過抑制炎癥發揮保護β細胞，改善胰島素抵抗作用從而達到降低血糖的目的。還有研究[13]表明，紅景天通過調節相關抗氧化酶的活性進而改善糖尿病模型動物氧化應激狀態，從而達到抗糖尿病的作用。

食品輻照技術是一項安全、無污染對食品品質風味影響小的食品保藏技術[14]。其中60Co-γ射線輻照滅菌法近年來在中藥滅菌中得到越來越廣泛的應用[15]。有研究[16]發現，輻照能使提取物活性成分發生變化，如輻照處理能提升人參皂苷的含量，增加其活性，包括腫瘤抑制、抗轉移、抗癌、保肝、神經保護和免疫刺激活動。但目前尚無輻照處理紅景天提取物的降血糖方面的研究。

研究擬采用不同輻照劑量60Co-γ射線對紅景天進行輻照處理，通過HPLC分析輻照前(0 kGy)后RRE化合物并對1型糖尿病小鼠進行體內試驗，研究其降血糖作用及對相關指標的變化，以期為輻照紅景天提取物在降血糖作用上的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

高山紅景天：由長白山科學研究院提供，并于四川省原子能研究院進行輻照處理；

無水乙醇：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

紅景天苷標準品、酪醇標準品、絡塞維標準品：色譜級(≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；

甲醇、乙腈、2-丙醇：色譜級(≥99.9%)，北京經科宏達生物技術有限公司；

鏈脲佐菌素(STZ)：純度≥98%，美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍緩釋片：0.5 g/片，天方藥業有限公司；

葡萄糖：藥用級，濰坊盛泰藥業有限公司；

總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、糖化血紅蛋白(GHb)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器設備

電熱恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海百典儀器設備有限公司；

電子分析天平：JJ-BC型，生工生物工程(上海)股份有限公司；

醫用離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

冷凝器：CCA-1111-CE型，東京理化器械株式會社；

水浴鍋：OSB-2100-CE型，東京理化器械株式會社；

旋蒸支架：N-1110型，東京理化器械株式會社；

真空泵：DTC-22B型，日本Uluac Kiko公司；

冷凍干燥機：LyoQuest-85實驗型，西班牙Telstar集團；

高效液相色譜儀：安捷倫1290+型，美國安捷倫科技有限公司；

多功能熒光酶標儀：SP-Max3500FL型，上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紅景天的輻照處理 將高山紅景天根送于四川省原子能研究院，以60Co-γ射線作為輻射源，依次按照0，5，10，20，30 kGy的輻照劑量進行處理。

1.2.2 輻照紅景天提取物的制備 紅景天粉碎處理后，過60目篩，用70%乙醇按照m紅景天粉∶V乙醇=1∶10 (g/mL)的料液比在80 ℃水浴中浸提1 h后，3 000 r/min 離心20 min，匯集上清液，沉淀物按照上述條件再次提取，共提取3次，將其蒸發濃縮后放入-80 ℃冰箱中冷凍12～24 h后，冷凍干燥24 h后研磨成粉末，常溫下密封保存，以備后續試驗使用。

1.2.3 提取物活性成分 采用高效液相色譜法(HPLC)。稱量不同輻照劑量RRE粉末50 mg，用甲醇定容，體積為5 mL，配制成10 mg/mL的溶液，裝入1.5 mL進樣瓶中前用0.45 μm濾膜過濾。以C18色譜柱為固定相，柱溫40 ℃，進樣體積10 μL，流動相恒定流量1.0 mL/min，流動相A為水，流動相B為乙腈，將A、B兩個流動相按照設定體積比梯度洗脫，開始時V流動相A∶V流動相B為95∶5，25 min時V流動相A∶V流動相B為85∶15，50 min時V流動相A∶V流動相B為78∶22，紅景天苷和酪醇在275 nm的紫外波長下進行檢測，絡塞維在254 nm的紫外波長下進行檢測[17]。

1.2.4 1型糖尿病動物模型的建立及分組 將7周齡體重為18～22 g的C57BL/6雄性小鼠50只按照每組6只的數量隨機分成8組，分別記為正常組、模型組、陽性對照組(陽性組)、0 kGy組、5 kGy組、10 kGy組、20 kGy組、30 kGy組，稱重，并于延邊大學食品研究中心動物室喂養，喂養條件為室內濕度(55±5)%，室溫(24±1) ℃，對小鼠適應性喂養1周后，稱重，正常飲水但禁食6 h(8:00—14:00)，測定空腹血糖水平并記錄。隔天所有小鼠禁食不禁水12 h，注射STZ，劑量為50 mg/kg。注射結束1 h后對所有小鼠恢復飲食，并于20:00繼續禁食，接連5 d 腹腔注射STZ來建立1型糖尿病模型。造模的小鼠全部進行1周的正常喂養后，正常飲水但禁食6 h后進行空腹血糖值的測定，數值>11.1 mmol/L即認定建模成功[18]，將建模不成功的剔除。

1.2.5 動物試驗流程 成功造模后，按照表1每天對小鼠進行灌胃給藥，試驗期間每周固定時間測定空腹血糖值，灌胃6周后，最后1 d測定小鼠的空腹血糖值，以及口服葡萄糖耐量試驗，于21:00到次日9:00禁食。禁食結束后，先眼球取血后把血液放于1.5 mL EP管中，之后將其脫頸處死，解剖，取心、肝、脾、腎4個臟器，處理后稱重并記錄。在4 000 r/min 的轉速下離心5 min后取上清液，以備后續使用。

1.2.6 小鼠體重、攝食量、飲水量及臟器系數測定 小鼠適應環境喂養1周后，記錄體重、飲水量以及飼料使用量，造模成功后，再次測量體重并記錄，進行灌胃之后，每隔1 d測量體重并記錄，小鼠處死前最后一次稱重并記錄，解剖，將心、肝、脾、腎4個臟器取出后測量其重量并記錄、計算各臟器系數。

1.2.7 小鼠空腹血糖值測定 測定時，將小鼠尾尖剪開后擦掉第1滴血用第2滴血進行測定，測定后用75%酒精處理尾部傷口來達到消毒的目的，并將小鼠放回原籠。

表1 不同輻照劑量RRE降血糖作用動物試驗分組

1.2.8 口服葡萄糖耐量試驗 在為期6周的灌胃后，首先測定所有小鼠的空腹血糖，然后經口灌胃質量分數為40%的葡萄糖溶液，分別在灌胃葡萄糖溶液后的0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 h時測定小鼠血糖水平。

1.2.9 小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、CAT、SOD水平測定 將解剖后存放的血清按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果與分析

2.1 輻照紅景天提取物得率

輻照劑量分別為0 kGy組、5 kGy組、10 kGy組、20 kGy 組和30 kGy組時輻照紅景天提取物得率分別為31.33%，31.32%，31.31%，31.31%，31.33%，各輻照劑量下用70%乙醇提取紅景天得到的提取物的得率之間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 輻照對RRE中主要活性成分的影響

圖1和圖2分別為275 nm和254 nm紫外波長下紅景天標準品和RRE的HPLC圖譜。由圖2可知，在60Co-γ射線輻照處理后，RRE的活性成分發生了變化。由表2可知，與未輻照RRE相比，輻照處理后紅景天苷的含量顯著減少(P<0.05)；在5，10，30 kGy處理的樣品中未檢測出酪醇，在20 kGy處理的樣品中檢測出酪醇；樣品經5，10，20 kGy處理時絡塞維的含量顯著提高(P<0.05)；經20 kGy處理時紅景天苷、酪醇以及絡塞維三者含量之和顯著高于其他輻照劑量處理的(P<0.05)。推測可能因為其他化合物在20 kGy時轉化合成為酪醇，所以在20 kGy 處理的樣品中檢測到酪醇。其次紅景天苷、酪醇和絡塞維可能對20 kGy的輻照劑量較敏感，所以成分含量之和顯著高于其他輻照劑量組。

圖1 275 nm和254 nm波長下紅景天標準品的HPLC圖譜Figure 1 HPLC chromatogram of Rhodiola rosea standards at 275 nm and 254 nm

圖2 275 nm和254 nm波長下RRE的HPLC圖譜Figure 2 HPLC chromatogram of RRE at 275 nm and 254 nm

表2 輻照前后RRE中紅景天苷、酪醇和絡塞維含量的變化?

2.3 輻照處理RRE對模型小鼠體重、攝食量、飲水量和食物效價的影響

由圖3可以看出，造模成功的小鼠體重低于正常組，并存在顯著性差異(P<0.05)，用RRE和鹽酸二甲雙胍灌胃后，隨灌胃次數增加，各給藥組小鼠體重都有所增加，但仍顯著低于正常組(P<0.05)，第9周時，20 kGy組的小鼠體重顯著高于其他輻照劑量組的(P<0.05)。表明RRE可以改善1型糖尿病小鼠體重減輕的癥狀，并且在20 kGy時對1型糖尿病小鼠體重改善效果較好。張露等[18]對輻照處理后的樺褐孔菌多糖的降血糖作用進行研究時，也發現樺褐孔菌多糖能夠改善糖尿病小鼠的糖尿病癥狀，使小鼠體重減輕的癥狀得到改善。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 RRE對小鼠體重的影響Figure 3 Effects of RRE on body weight of mice

從圖4可以看出，注射STZ的各組小鼠的體重增量低于正常組，且存在顯著性差異(P<0.05)，注射STZ的各組小鼠攝食量和飲水量均顯著高于正常組的(P<0.05)，但食物效價低于正常組并存在顯著性差異(P<0.05)，灌胃RRE的各組小鼠的攝食量和飲水量顯著低于模型組(P<0.05)而食物效價顯著高于模型組(P<0.05)，灌胃20 kGy RRE的小鼠的食物效價顯著高于灌胃其他輻照劑量的(P<0.05)，與劉素欣等[19]發現RRE能夠改善1型糖尿病小鼠的飲食狀態，提高1型糖尿病小鼠的食物利用率的試驗結果一致，并且20 kGy的RRE對于小鼠飲食狀態的改善效果較好。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 RRE對小鼠攝食量、飲水量和食物效價的影響Figure 4 Effects of RRE on food intake, water intake and food titer in mice

在試驗過程中1型糖尿病小鼠表現出了飲食量、飲水量以及排尿量過多而體重下降的現象，并且其對食物的利用率要低于正常組小鼠。試驗期間，注射STZ的1型糖尿病小鼠有時會表現出萎靡不振，毛色干燥，灌胃給藥后，小鼠的精神狀態好轉，隨著灌胃給藥，毛色由干燥轉變為黑光油亮；模型組小鼠的墊料明顯潮濕，灌胃給藥后，給藥組小鼠的墊料潮濕情況有所改善，所以說明RRE能夠改善小鼠的身體、精神狀態和墊料潮濕情況，并且20 kGy 的RRE效果最好。

2.4 輻照處理前后的RRE對小鼠空腹血糖值的影響

由圖5可知，建模后，與正常組相比，模型組空腹血糖水平顯著上升(P<0.05)，經不同輻照劑量RRE灌胃后，各組小鼠空腹血糖水平均有所改善，且20 kGy組水平顯著低于模型組(P<0.05)，同時顯著低于其他各輻照劑量組(P<0.05)。表明RRE能夠降低1型糖尿病小鼠空腹血糖水平，并且20 kGy的RRE降血糖效果優于其他輻照劑量的。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 RRE對小鼠空腹血糖值的影響Figure 5 Effects of RRE on fasting blood glucose in mice

2.5 RRE對小鼠口服葡萄糖耐量的影響

由圖6(a)可知，經口灌胃葡萄糖溶液后，正常組小鼠血糖水平緩慢上升，其余組別小鼠血糖水平急劇上升，在0.5 h時達到最大，0.5 h以后所有組別小鼠血糖水平逐漸下降，在2 h時20 kGy組的小鼠血糖水平接近灌胃葡萄糖之前的水平，與0.5 h時的血糖水平相比，2 h時20 kGy組的小鼠血糖水平下降了41.24%，下降幅度僅次于陽性組且高于其他輻照劑量組，所有給藥組小鼠的血糖值均顯著低于模型組(P<0.05)。由圖6(b)可知，與模型組相比灌胃RRE的小鼠糖耐量顯著提高(P<0.05)，并且20 kGy 組的糖耐量顯著高于其他輻照劑量組的(P<0.05)。因此RRE能夠改善由STZ導致的小鼠的糖耐量損傷，并且20 kGy的RRE對小鼠糖耐量的改善效果較好，表明其具有提高STZ誘導的1型糖尿病小鼠抗高血糖的潛力。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 RRE對小鼠口服葡萄糖耐量的影響Figure 6 Effects of RRE on oral glucose tolerance in mice

2.6 RRE對小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、CAT和SOD的影響

糖尿病病人機體胰島素本身不足會導致脂蛋白脂肪酶活性下降，從而引起其對TG的水解能力減弱，致使與TG相關的脂蛋白出現代謝障礙，使TG含量升高而高密度脂蛋白(HDL)含量減少，進而使HDL從周圍組織中將膽固醇轉運至肝臟的能力減弱，導致體內膽固醇因不能轉化和排泄而使TC含量升高[20]。由圖7(a)和圖7(b)可知，注射STZ的小鼠其血清中TC和TG含量顯著高于正常組(P<0.05)，灌胃RRE后，灌胃的各組小鼠其血清中TC和TG含量顯著低于模型組的(P<0.05)，并且20 kGy組血清中的TC和TG含量顯著低于其他輻照劑量組的(P<0.05)。表明RRE能夠降低STZ誘導的1型糖尿病小鼠血清中TC和TG的含量，并且20 kGy的RRE降低TC和TG含量的效果較好。

由圖7(c)可知，注射STZ的1型糖尿病小鼠GHb含量顯著高于正常組(P<0.05)，灌胃RRE的各組小鼠血清中GHb含量低于模型組并存在顯著性(P<0.05)，其中20 kGy組小鼠GHb含量顯著低于灌胃其他輻照劑量的(P<0.05)，表明RRE能夠降低由STZ誘導的1型糖尿病小鼠糖化血紅蛋白的含量，并且20 kGy的RRE降低糖化血紅蛋白含量的效果較好。

MDA、CAT與SOD在機體中具有較強的抗氧化能力，壓制氧自由基的生成，可降低其對細胞的傷害，并且可以降低MDA的生成量[21]。由圖7(d)～圖7(f)可知，注射STZ的小鼠血清中MDA含量高于正常組并存在顯著性差異(P<0.05)，CAT和SOD活力顯著低于正常組(P<0.05)，與模型組相比灌胃RRE的各組小鼠血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)而CAT和SOD活力顯著提高(P<0.05)，20 kGy組小鼠血清中MDA含量顯著低于其他輻照劑量的(P<0.05)，CAT和SOD活力顯著高于其他輻照劑量的(P<0.05)。因此RRE能夠降低STZ誘導的1型糖尿病小鼠血清內MDA含量，并提高CAT和SOD活力，表明RRE能夠提高1型糖尿病小鼠的抗氧化能力，具有降血糖的效果。20 kGy輻照處理的RRE的抗氧化效果較好。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 RRE對小鼠血液TC、TG、GHb、MDA、CAT和SOD的影響Figure 7 Effects of RRE on blood TC, TG, GHb, MDA, CAT and SOD in mice

2.7 RRE對小鼠臟器系數的影響

由表3可知，注射STZ建模后，模型組小鼠脾臟臟器系數與正常組相比不存在顯著性差異(P>0.05)，表明STZ未造成小鼠脾臟的腫大，并且灌胃RRE的小鼠脾臟與正常組相比也無顯著性差異(P>0.05)，說明RRE不會對小鼠脾臟造成傷害。但在建模后，注射STZ的小鼠心、肝、腎的臟器系數高于正常組并存在顯著性差異(P<0.05)，經口灌胃RRE的小鼠其心、肝、腎的臟器系數顯著小于模型組(P<0.05)，表明RRE能夠緩解1型糖尿病小鼠臟器腫大的現象。在灌胃RRE的組別中，20 kGy組的臟器系數顯著低于其他輻照劑量的(P<0.05)，說明20 kGy 輻照處理的RRE緩解1型糖尿病小鼠臟器腫大的效果較好。

表3 RRE對小鼠臟器系數的影響?

3 結論

不同輻照劑量的60Co-γ射線處理會影響紅景天提取物活性成分，改善其對1型糖尿病小鼠相關指標的水平，降血糖作用顯著，且20 kGy時效果最佳。但該試驗僅研究了輻照劑量對降血糖效果的影響，后續將進一步研究最佳輻照劑量下的降血糖作用，并通過體內外試驗探討其降血糖機制。