基于NMR和1H-MRI技術的不同糖度錦繡黃桃耐貯性評價

周慧娟 葉正文 張志強 杜紀紅 曾思懿

(1. 上海市農業科學院林木果樹研究所，上海 201403；2. 上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403; 3. 上海思而騰農業科技發展有限公司，上海 201407)

錦系列鮮食黃桃是中國長江以南的主栽品種[1]，常溫不耐貯運，長期的低溫冷藏易出現果肉褐變、糖酸比失調、揮發性物質喪失或異常積累等冷害癥狀。糖代謝可介導果實的風味代謝和成熟衰老進程，因此糖含量與黃桃果實冷害程度[2]和果實的貯運特性密切相關[3-4]。貯藏期間，水分通過參與果實的新陳代謝而影響內外品質的變化，水分狀態和含量與果實的新鮮度和風味特征密切相關[5]。Herppich等[6]報道，胡蘿卜水分狀態與貯藏期間果實的硬度變化顯著相關。

傳統的果實水分測定方法無法區分水分狀態，不能科學地解釋水分與果實品質的相關性。核磁共振技術(NMR)通過測定氫質子密度變化來判定果蔬中水分的狀態、分布及遷移規律，是一種無損檢測技術[7-8]。Zhu等[9]采用NMR及成像技術研究貯藏期櫻桃水分變化，結果表明櫻桃樣品組織的軟化現象與水分損失密切相關，新鮮組織中水分分布均勻，隨著貯藏時間的延長，游離水含量逐漸增加，從而引起組織內部損傷。Fundo等[10]利用NMR技術檢測鮮切梨的水分狀態，發現貯藏過程中水的狀態變化與果實硬度、色差等密切相關。質子核磁共振成像(1H-MRI)技術可以激發物體吸收射頻(RF)能量的能力，它不僅可以提供果蔬內部結構的高分辨率圖像，還可以檢測果蔬的內部損傷并評估果蔬耐貯性[11-15]。

研究擬以上海市農業科學院自主育成的錦繡黃桃為研究對象，測定不同糖含量黃桃在貯藏期間的TSS含量、呼吸強度、乙烯釋放速率、果實質構的變化再利用NMR和1H-MRI技術測定貯藏期和貨架期黃桃的水分含量及分布狀態以評估黃桃的耐貯性，以期為果實品質智能檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以上海市農業科學院果樹種植基地種植的錦繡黃桃果實為試材，試驗園樹齡10年，果實套黃袋。2021年8月16日，分別于60株樹冠外圍高約1～2 m處隨機采取5 000個硬度一致、大小均勻、色澤均一、無機械傷和病蟲害的果實，立即運回上海市農業科學院林木果樹研究所實驗室和冷庫進行處理。

防霧保鮮袋：0.03 mm，零度包裝科技有限公司；

無損糖度計：H100F型，北京陽光億事達科技有限公司；

質構儀：TA. XT. Plus C型，英國SMS公司；

折光儀：ATAGO-1型，日本ATAGO公司；

氣相色譜儀：GC7890A型，美國安捷倫科技公司；

紅外線CO2氣體分析儀：GXH-305型，泰仕電子工業股份有限公司；

核磁共振分析與成像系統：MZsoMR23-150H-I型，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理 在果肉組織硬度一致的前提下(果肉組織硬度15～21 N)，用無損糖度計對5 000個果實進行糖度測定并按照可溶性固形物含量(TSS)大小，將果實分為高糖組、中糖組、低糖組，詳細見表1。每個處理組200個果實，每組設3個平行，共計1 800個果實。將各組果實置于溫度為2～4 ℃、相對濕度為85%～90%的冷庫中預冷和貯藏，在冷藏第0，14，21，28，35，(35+3)(即貯藏35 d后置于貨架常溫存放3 d)天時測定果實的呼吸強度、乙烯釋放速率、可溶性固形物含量和果實質構，并利用NMR和1H-MRI技術測定各組果實的A2、T2及質子密度像。

表1 高、中、低糖組果實入庫初始品質

1.2.2 指標測定

(1) 乙烯釋放速率：參照王淼等[16]的方法稍加修改。15 ℃條件下，將5個桃子放置于容器為4 L的密閉容器中密封1 h，吸取1 mL混合氣體，注入氣相色譜儀中測定乙烯含量。

(2) 呼吸強度：參照周慧娟等[1]的方法，隨機取5個果實，稱重，置于與紅外線CO2分析儀氣路相連的4 L密閉塑容器中，15 ℃下測定CO2釋放速率。

(3) 可溶性固形物(TSS):隨機取20個果實，取果實縫合線左右赤道處對稱部位果肉，用手持阿貝折光儀測定未經稀釋的汁液可溶性固形物含量。

(4) 質構測定：質構儀的圓柱形探頭(P/5)直徑為5 mm，選用Two Deformation Test (TDT)進行兩次下壓，測前速度60 mm/min，測試速度120 mm/min，測后速度600 mm/min，觸發力0.049 N。第一次下壓距離為3 mm，測定參數為果皮硬度、果皮脆性，第二次下壓距離為20 mm，獲得參數為果肉硬度、果肉緊實度、果肉脆性。

(5) 自由水含量(A2)、弛豫時間(T2)和質子密度像：核磁共振分析與成像系統參數設置：硬脈沖90°脈寬5.8 μs，硬脈沖180°脈寬為10.64 μs，重復采樣等待時間為6 000 ms，回波個數為15 000，重復采樣次數為4，接受機帶寬為50 kHz。將所得的測試數據進行10萬次反演，得到橫向弛豫時T2圖譜。

1H-MRI運用MRI成像軟件及MSE多層自旋回波序列采集樣品橫斷面的質子密度圖像。MRI成像參數：GSliceZ為-210，GPhaseY為40，GReadX為-40，TR為2 000 ms，TE為120 ms，累加2次，空間大小256×256。

1.3 數據處理

所有試驗均設3次重復，使用Simca-p軟件和SPSS 17.0軟件進行主成分分析(PCA)和方差統計分析(ANOVA)；采用Tukey方法對數據進行顯著差異分析，結果以平均值±標準偏差表示。利用蘇州紐邁分析儀器股份有限公司自主研發的核磁共振分析應用軟件Ver 1.0分析圖譜；利用Origin軟件分析橫向弛豫時間T2圖譜。

2 結果與分析

2.1 可溶性固形物含量

由圖1可知，高、中、低糖組果實均在貯藏的第28天出現TSS峰值，高糖組和中糖組果實TSS峰值顯著高于低糖組果實(P<0.05)。貯藏后期(第28～35天)各組TSS呈下降趨勢，說明果實品質劣變；貨架期間，高、中、低糖組果實TSS含量均呈上升趨勢，說明貯藏35 d后的錦繡黃桃，放置于常溫(20～25 ℃)貨架時，仍存在內含物代謝進程；整個貯藏期間，高糖組和中糖組果實TSS含量顯著高于低糖組(P<0.05)，說明提高果實的糖含量有利于提高果實的低溫耐貯性，果實入庫品質對貯藏和貨架品質及后熟代謝進程密切相關[17]。

同一貯藏時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.2 乙烯釋放速率和呼吸強度

由圖2可知，高、中、低糖組果實均在貯藏第28天出現呼吸強度高峰，且峰值無顯著性差異。貯藏第0～21天，中、低糖組果實的呼吸強度顯著高于高糖組的；貨架期間，高、中、低糖組果實的呼吸強度均呈急劇上升趨勢且高、低糖組果實的呼吸強度顯著高于中糖組的(P<0.05)。

在貯藏的第14天，低糖組果實出現乙烯釋放高峰，高、中糖組果實較低糖組果實延緩14 d出現乙烯釋放高峰，且乙烯釋放高峰值顯著低于低糖組果實(P<0.05)，與高糖含量可較好地維持冷藏期間桃果實膜穩定性、增強耐冷性有關[18]；貨架期間，高、中、低糖組果實乙烯釋放速率呈急劇上升趨勢，高糖組果實的乙烯釋放速率顯著高于中、低糖組果實的(P<0.05)。高糖組果實的呼吸強度高但乙烯釋放速率低，具體機理需進一步研究。

同一貯藏時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)圖2 各組果實呼吸強度和乙烯釋放速率隨時間變化規律Figure 2 The respiratory intensity and ethylene release rate of furits in each group changed with time

2.3 質構

由圖3可知，貯藏前期(0～21 d)，高、中、低糖組果實的帶皮硬度、果肉組織硬度、果肉緊實度及果實咀嚼性均較穩定，貯藏后期(21～35 d)，各組的質構參數值呈下降趨勢。貯藏0～28 d時，高糖組果實的帶皮硬度、果肉組織硬度、果肉緊實度及果實咀嚼性均高于低糖組果實的，說明高糖組果實質構特性佳；高、中糖組果實的果肉組織硬度、果肉緊實度及果實咀嚼性無顯著差異。貨架期間，高、中、低糖組果實的帶皮硬度、果肉組織硬度、果肉緊實度及果實咀嚼性進一步下降，且各組間無顯著差異，說明在同等成熟度條件下，當錦繡黃桃果實的可溶性固形物含量低于12%時，貯藏期間果實的質構會受到一定的影響，進一步說明入庫品質對貯藏和貨架品質影響的重要性。

可溶性固形物含量、果實呼吸強度、乙烯釋放速率和果實質構的測定均損壞了果實樣品，而NMR和1H-MRI是無損測定技術，可用于評價不同糖度等級黃桃果實耐貯性的差異性。

同一貯藏時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)圖3 高、中、低糖組果實質構特性的變化Figure 3 Changes of fruit texture properties in high, medium, and low sugar groups

2.4 T2和A2

T2反映了氫質子的結合力和自由度，與果實質地密不可分[19]。束縛的氫質子越多或自由度越小，T2越短；T2拉長，峰值右移[20]。圖4為錦繡黃桃的T2弛豫譜，T2在500～1 000 ms時，果肉細胞毛細管中的水被定義為自由水，其對應的峰積分面積經計算后得自由水含量為A2，與Zhou等[21]的結論一致，與馮蕾[5]在黃瓜和櫻桃中報道的4個峰值有一定差異，可能與錦繡黃桃果實中的水主要以自由水的狀態存在有關。

圖4 入庫時錦繡黃桃果實的弛豫時間和自由水含量

2.5 果實內部質子密度及水分分布

貯藏期間，果蔬的細胞結構和完整性發生改變，膜的滲透性增加，從而導致水分遷移[22]。1H-MRI技術可直接評估貯藏和貨架期間高、中、低糖組果實內部水分分布和遷移情況，質子密度圖中藍色表示質子密度低，紅色表示質子密度高，紅色區域內氫質子、水分含量越多，亮度越大[23]。由表2可知，新鮮樣品(貯藏第0天)的水分分布比較均勻，水分含量較高，且果皮、果肉及果核的輪廓較清晰。隨著貯藏時間的延長，果實水分含量下降。對于低糖組，貯藏0～14 d，果實質子密度無顯著性變化，果實水分變化較小；貯藏21～35 d，果實內部質子密度降低，可能是因為破裂細胞的液體取代了細胞間隙中的空氣，減少了磁場梯度上的總界面面積，這與此期間果實帶皮硬度、果肉組織硬度、果肉緊實度及果實咀嚼性下降的趨勢一致[9]，說明該時間點為果實內部自由水含量降低的關鍵點，與果實品質劣變的關鍵時間點一致；貨架期間，低糖組果實內部質子密度進一步降低，與A2變化趨勢一致，果核周圍的水分散失較為明顯，果核與果肉間明顯出現一條縫隙，果肉中靠近果皮的水分也在輕微的減少，可能是因為貨架期間溫度驟然升高導致黃桃果實呼吸強度增強從而加速水分散失，靠近果核處的呼吸強度較靠近果皮處的強，與黃瓜樣品果實水分含量的變化和遷移過程主要發生在果肉部分的結論[5]一致。對于高糖組，貯藏0～21 d，果實內部質子密度變化不顯著，水分分布比較均勻，水分含量較高；貯藏21～35 d及貨架期間，果實內部質子密度呈增加趨勢，亮度增加，說明果實內部自由水含量較高，較好地保持了果實固有品質。Mazhar等[22]研究表明，水分含量的變化及水分遷移的過程與果實細胞壁的分解等物理化學變化密切相關。低糖組錦繡黃桃果實自由水含量損失較多可能是因為長期冷藏導致果實細胞及細胞器膜通透性增加，使得水與大分子物質之間接觸而發生相互作用，從而產生相對流動性更強且易揮發的自由水[24-25]。綜上，高含量的可溶性固形物可以較好地保持錦繡黃桃貯藏期間果實細胞膜的完整性，產生抗冷性，提高果實的貯藏性。

2.6 基于自由水含量的主成分分析

為了觀察不同貯藏時間點高、中、低糖組黃桃果實的自由水含量是否有顯著差異，采用主成分分析方法對果實的自由水含量進行分析，如圖5所示。經過降維處理后貯藏期間高、中、低糖組黃桃果實兩個主成分的累計貢獻率為90.6%，其中第一主成分(PC1)的貢獻率為70.2%，第二主成分(PC2)的貢獻率為20.4%。結果表明，PC1和PC2可較好地反映樣本的自由水含量信息，高、中、低糖組及6個貯藏時間的果品在主成分空間中處于相對獨立的空間，得到了有效區分。PC1與3個變量(高糖組、中糖組和低糖組)較強相關，PC2主要與自由水信號和T2相關。由圖5可知，在PC1的投影上，高、中、低糖組果實的自由水含量和T2均隨貯藏時間發生了顯著性變化，且在同一貯藏時間下，高、中、低糖組果實從低到高變化的范圍逐漸變小，說明貯藏時間可以調控各組的自由水含量和T2的變化；在PC2的投影上，自由水含量和T2在不同組間的變化差異明顯大于組內的，說明可溶性固形物含量對果實自由水含量和T2的變化有顯著的調控作用。

表2 貯藏和貨架期間果實質子密度成像圖

圖5 貯藏期間黃桃果實自由水含量的主成分分析

2.7 基于自由水含量的聚類分析

選用層次聚類分析法中的最短距離法對貯藏及貨架期間高、中、低糖組果實自由水含量進行聚類分析，結果如圖6所示。高、中、低糖組果實的自由水含量被聚為3個類群，即由高糖組果實組成的類群Ⅰ，由中糖組果實組成的類群Ⅱ，由低糖組果實組成的類群Ⅲ，結果表明高糖組、中糖組和低糖組果實的自由水含量有顯著差異。

圖6 貯藏期間黃桃果實自由水含量的聚類分析Figure 6 Cluster analyses of free water content of yellow peach fruit during storage

在聚類分析的基礎上結合黃桃果實的自由水含量可進一步將不同貯藏時間的高、中、低糖組果實樣品聚為4個類群，類群Ⅰ包含貯藏0 d和14 d的果品，類群Ⅱ包含貯藏21 d的果品，類群Ⅲ包含貯藏28 d和35 d的果品，類群Ⅳ包含第38天(即貨架期第3天)的果品，聚類結果與黃桃果實貯藏品質的結果一致，隨著時間的延長，果實的品質和自由水含量發生變化。

2.8 果實內部水分遷移及水分流動性

馮蕾[5]報道，果蔬內部有4種狀態的水存在，分為細胞壁水、細胞質水、細胞間隙水及液泡水，其中液泡水(自由水)流動性最強。貯藏期間，自由水最先流失，自由水含量(A2)是果實品質的重要指標[26]，黃桃果實T2和A2與果實的軟化密切相關[21]。NMR技術可有效地監測和預測桃貯藏過程中的水分含量。由表1和圖7可知，隨著貯藏時間的延長，中糖和低糖組果實A2呈下降趨勢。低糖組果實在貯藏的第14天出現乙烯釋放高峰，在貯藏的第21天出現果實硬度和自由水含量呈急劇下降趨勢，最后在貯藏第28天出現呼吸強度釋放高峰，說明自由水含量的變化與果實的質構密切相關[21]。高含量的糖可抑制貯藏期間果實A2的下降，使果實保持較高的自由水含量和果肉組織硬度及緊實度；貨架期間，高糖組果實A2呈顯著上升趨勢，進一步說明了高糖組果實可保持較高的新鮮度和較好的固有品質狀態，與Zhu等[9]報道的櫻桃樣品組織的軟化現象與貯藏過程中的水分損失密切相關的結論一致。

隨著貯藏時間的延長，低糖組果實自由水含量降低，果肉水分逐漸向內遷移，與陳森等[27]報道的櫻桃在常溫貯藏和低溫條件下的水分遷移規律一致，說明貯藏期間低糖組果實內自由水含量降低，且貨架期間果實的軟化未引起汁液的增加，與冷害的發生癥狀一致。中、高糖組果實可保持較高的自由水含量，抑制果實自由水變為結合水而導致的果實冷害的發生，與M?ller等[28]報道的低溫貯藏可以降低黃桃中細胞質水和細胞間隙水的含量，提高液泡水的含量的結論一致。

T2對氫質子的狀態變化較為敏感，而果蔬中的氫質子主要來源于水分子及糖類物質，因此在貯藏過程中，由于代謝作用，馳豫時間隨水分及糖含量發生變化。由圖8可知，在貯藏第0～21天時，中糖組和低糖組果實弛豫時間(T2)不變，說明果實中被束縛的氫質子較多，內部結構緊密，結合力大；隨著貯藏時間的延長(貯藏21～35 d及貨架期間)，中糖和低糖組果實弛豫時間延長，峰值持續右移，說明果實中被束縛的氫質子降低或自由度變大，與該期間果實帶皮硬度、果肉組織硬度、果肉緊實度及果實咀嚼性下降的趨勢一致。貯藏14～35 d及貨架期間，高糖組果實弛豫時間(T2)延長，峰值持續右移，高糖組持續時間較果實軟化點提前7 d出現，說明果實中的含糖量可能影響弛豫時間，與高糖果實中被束縛的氫質子較少或自由度大有關[20]。整個貯藏和貨架期間，高、中糖組果實A2和T2顯著高于低糖組果實，說明整個冷藏期內高中糖組果實可保持較高的自由水含量，貨架期間果實可正常軟化，汁液豐富。

同一貯藏時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)圖7 貯藏和貨架期間錦繡黃桃的自由水含量的變化

同一貯藏時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)圖8 貯藏和貨架期間錦繡黃桃的弛豫時間的變化

3 結論

以錦繡黃桃為研究對象，測定不同貯藏期間黃桃的可溶性固形物含量、呼吸強度、乙烯釋放速率、果實質構的變化，再利用核磁共振技術和質子核磁共振成像技術測定貯藏期和貨架期黃桃的水分含量及分布狀態以評估黃桃的耐貯性。結果表明，入庫時可溶性固形物含量低于12%時，貯藏期的果實品質下降，因此入庫時可溶性固形物含量應不低于12%；低、中、高糖組黃桃中，高糖組黃桃的自由水含量最高，耐貯性最好，可以通過抑制果實自由水變為結合水從而保持較好的品質；0～14 d為高、中糖組錦繡黃桃的優質保鮮期，21 d為安全保鮮期，28～35 d為品質劣變期，貨架期可達3 d。果實自由水含量和質子核磁共振成像與果實質地的相關性需進一步研究和驗證，如何將質子核磁共振成像技術與果品的無損分選設備相結合也是未來的研究方向之一。