血清miR-301a、miR-197與GDM患者炎性細胞因子的相關(guān)性及預(yù)測妊娠結(jié)局的ROC分析

吳海芳，張海波，黃素靜，韓一栩

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)會引發(fā)孕晚期流產(chǎn)、難產(chǎn)、先兆子癇及心血管疾病等不良結(jié)局，并且患兒為巨大兒、低血糖、窒息、合并代謝綜合征的風險隨之增高，嚴重威脅母嬰健康[1]。臨床研究表明，胰島素抵抗是GDM的主要發(fā)病機制[2]。白細胞計數(shù)(WBC)是最常見的炎性指標因子，有研究證明，WBC可作為GDM的預(yù)測因子；白介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在GDM患者血清和胎盤組織中表達異常；C反應(yīng)蛋白(CRP)主要由肝細胞合成，主要用于反映炎性反應(yīng)。微小RNA(miRNA)可參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。多項研究證實，多種miRNA與2型糖尿病的發(fā)生、進展密切相關(guān)[3-4]，但是其與GDM相關(guān)性研究的報道較少。因此，現(xiàn)分析血清miR-301a、miR-197與GDM患者炎性細胞因子的相關(guān)性及預(yù)測妊娠結(jié)局的價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年1月于海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科行產(chǎn)檢并分娩的確診GDM孕婦45例為觀察組，并按照妊娠結(jié)局分為良好亞組25例和不良亞組20例。另選取同時期在醫(yī)院產(chǎn)檢并分娩的健康孕婦45例為對照組。3組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、孕周等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(KY20191226318)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①觀察組均符合“妊娠合并糖尿病診治指南(2014) ”[5]中相關(guān)診斷標準，0、1、2、3 h血糖界值分別為5.3、10.0、8.6、7.8 mmol/L，2個及以上時點≥上述數(shù)值診斷為GDM；②研究期間未服用糖皮質(zhì)激素進行治療。(2)排除標準：①合并嚴重神經(jīng)精神損害者；②存在嚴重免疫系統(tǒng)疾病者；③合并心、肝、腎等器質(zhì)病變者。

表1 3組一般資料比較

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-301a、miR-197檢測：采集孕婦24～28周時晨起空腹靜脈血5 ml，離心取上層血清，采用Trizol試劑盒提取總RNA，加入Trizol充分混勻后靜置，乙醇沉淀并清洗RNA，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA。取總RNA 2 μl作為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 為 cDNA，每個檢測樣本設(shè)3個復孔，以U6位內(nèi)參照。miRNA表達量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=CtmiRNA-CtU6。試劑盒由杭州碧云天公司提供。

1.3.2 WBC及血清IL-1、IL-6、TNF-α、CRP檢測：上述血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平；采用全自動細胞分析儀(sysmex XE500)測定WBC水平。試劑盒由杭州碧云天公司提供。

1.3.3 妊娠結(jié)局：統(tǒng)計觀察組孕婦的妊娠結(jié)局，妊娠結(jié)局不良是指產(chǎn)婦發(fā)生產(chǎn)后出血、產(chǎn)褥感染及新生兒窒息、圍產(chǎn)兒死亡等不良事件；妊娠結(jié)局良好是指生產(chǎn)順利，母嬰均無不良事件發(fā)生。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-301a、miR-197水平比較 觀察組血清miR-301a高于對照組，miR-197低于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 對照組與觀察組產(chǎn)婦血清miR-301a、miR-197水平比較

2.2 2組炎性因子水平比較 觀察組WBC及血清IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平均高于對照組(P<0.01)，見表3。

表3 對照組與觀察組產(chǎn)婦炎性因子水平比較

2.3 觀察組妊娠結(jié)局 良好亞組25例妊娠結(jié)局良好，母嬰均無不良事件發(fā)生；不良亞組20例妊娠結(jié)局不良，其中產(chǎn)婦發(fā)生產(chǎn)后出血12例，產(chǎn)后發(fā)生產(chǎn)褥感染7例，新生兒發(fā)生窒息1例。

2.4 血清miR-301a、miR-197水平與炎性細胞因子相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miR-301a與WBC、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平呈正相關(guān)(P<0.05)，血清miR-197與WBC、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平呈負相關(guān)(P<0.01)，見表4。

表4 血清miR-301a、miR-197水平與炎性細胞因子水平相關(guān)性分析

2.5 影響GDM患者妊娠結(jié)局的多因素Logistic回歸分析 以GDM患者妊娠結(jié)局為因變量，以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-301a升高、miR-197降低均是影響GDM患者妊娠不良結(jié)局的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響GDM患者妊娠不良結(jié)局的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清miR-301a、miR-197對GDM患者妊娠結(jié)局的預(yù)測價值 繪制ROC曲線結(jié)果顯示，血清miR-301a、miR-197及二者聯(lián)合預(yù)測GDM患者妊娠結(jié)局的AUC分別為0.785、0.804、0.954，二者聯(lián)合預(yù)測的AUC均高于單項檢測(Z=5.239、4.263，P均<0.001)，見圖1、表6。

表6 血清miR-301a、miR-197對妊娠結(jié)局的預(yù)測價值

圖1 血清miR-301a、miR-197預(yù)測妊娠結(jié)局的ROC曲線

3 討 論

GDM與妊娠結(jié)局密切相關(guān)。既往有研究結(jié)果顯示，胰島素抵抗是GDM發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，多數(shù)孕婦的胰島素分泌量可維持正常的糖代謝，而少數(shù)孕婦無法代償上述變化，出現(xiàn)胰島素抵抗，最終導致GDM的發(fā)生[6]。越來越多的研究表明，糖尿病患者存在體內(nèi)細胞因子介導的慢性炎性反應(yīng)，巨噬細胞、單核細胞及炎性因子可能參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。GDM患者體內(nèi)存在相同的發(fā)病機制，少數(shù)GDM患者在妊娠后期會發(fā)展成2型糖尿病，因此這種免疫反應(yīng)誘發(fā)的炎性反應(yīng)也加重了GDM患者的胰島素抵抗。隨著基因檢測技術(shù)的推廣，miRNA在GDM發(fā)病中的作用逐漸成為GDM研究的重點內(nèi)容。

miRNA是一種單鏈的非編碼RNA，由19～25個核苷酸組成，miRNA基因可位于整個基因組的任何位置，也可位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子，但不論來自何處，其生物合成的過程基本相同[9]。miRNA基因可參與人體正常的生理過程，miRNA對神經(jīng)元的發(fā)育重塑、樹突棘的發(fā)育、杏仁核依賴記憶的形成及神經(jīng)細胞有絲分裂后的存活均有重要作用[10]。有研究也證實miRNA與低分化乳腺癌、胃癌等多種癌癥相關(guān)，其在糖代謝異常、胰島素分泌、胰島素抵抗等的發(fā)生過程中發(fā)揮了必不可少的作用[11]。另外miRNA可由胎盤分泌，并且穩(wěn)定存在于母體，可通過調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程，參與胰島素抵抗、糖代謝等妊娠期糖尿病的發(fā)病機制中，使其發(fā)生胎盤異常、胎兒血管內(nèi)皮損傷等病理學改變，還可影響胎兒生長發(fā)育，對胎兒和母胎造成嚴重影響。其中miR-301a、miR-197是非常典型的miRNA基因，有學者證實，miR-301a、miR-197水平與機體炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)有關(guān)，miR-301a水平升高，miR-197水平降低，會導致促炎因子水平升高，損害有關(guān)器官結(jié)構(gòu)和功能。本研究結(jié)果顯示，觀察組WBC及血清miR-301a、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平高于對照組，miR-197低于對照組，Manani等[12]研究表明，miRNA在GDM患者妊娠過程中發(fā)揮代謝和發(fā)育調(diào)節(jié)劑功能，可能參與其發(fā)病和妊娠結(jié)局等過程。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-301a與炎性因子水平呈正相關(guān)，miR-197與炎性因子水平呈負相關(guān)，表明血清miR-301a、miR-197的異常表達與妊娠期糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其可作為預(yù)測和治療妊娠期糖尿病的重要靶點，與張幫林等[13]研究結(jié)果一致。

正常妊娠期間，T細胞的平衡從促炎性Th1轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔訲h2，當機體免疫功能紊亂時，保護性抗炎因子水平降低，胰島β細胞功能紊亂[14]。miR-301a水平增加導致促炎因子水平升高，T細胞的平衡性轉(zhuǎn)換受阻，引發(fā)胰島素抵抗。血清IL-6可通過NF-κB炎性信號傳導通路參與炎性反應(yīng)，促使糖皮質(zhì)激素分泌，升高血糖[15]。血清CRP與胰島素抵抗密切相關(guān)，其會擾亂胰島素合成和分泌機制，進而導致胰島素抵抗加重[16]。血清TNF-α介導免疫炎性反應(yīng)多個過程。上述結(jié)果進一步證實了血清IL-1、IL-6、TNF-α、CRP是促使胰島素抵抗的重要炎性因子[17]。本研究結(jié)果還顯示，二者聯(lián)合預(yù)測GDM患者妊娠結(jié)局的診斷價值極高，提示血清miR-301a、miR-197有望作為GDM的潛在診斷指標，但這需要進一步擴大樣本量及長期隨訪研究證實。

綜上，血清miR-301a、miR-197的異常表達與妊娠期糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其可通過調(diào)節(jié)抗炎和促炎的失衡導致妊娠期糖尿病的發(fā)生，二者聯(lián)合檢測對妊娠結(jié)局的預(yù)測價值較高，可作為治療妊娠期糖尿病的重要靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

吳海芳：課題設(shè)計，實施研究過程，論文撰寫；張海波：提出研究思路，論文審核，實施研究過程，進行統(tǒng)計學分析；黃素靜：實施研究過程，數(shù)據(jù)收集；韓一栩：實施研究過程，參與論文修改