吸入高濃度氫氣對大鼠肺缺血再灌注損傷的影響

李喆 呂建瑞 周華成

肺移植是治療終末期肺部疾病的公認方法。在肺移植中，缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury , IRI)是限制肺移植成功的重要因素[1]，因此預防和治療肺IRI在臨床上都很重要。炎癥反應和氧化應激是肺IRI的主要機制[2]。氫氣具有抗炎癥和抗氧化應激的作用，并且和氫氣的濃度有關[3]。既往研究報道低濃度氫氣的肺損傷保護作用[4]，但是高濃度氫氣是否能更好的發揮肺損傷保護作用，尚未有研究。本研究將進一步探究高濃度氫氣對大鼠肺IRI的影響及作用機制。

資料與方法

一、實驗動物及分組

清潔級SD雄性大鼠，體重220～260 g，購自哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心。 SD大鼠隨機分成3組(n=10)：假手術組(Sham 組)、缺血再灌注組(I/R 組)和氫氣組(H2組)。

二、實驗方案

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉60mg/kg，氣管切開后，連接小動物呼吸機(683型，Harvard公司，美國)行機械通氣，潮氣量10mL/kg，呼吸頻率60次/分。左胸部去毛消毒，逐層分離暴露左側肺門。尾靜脈注射肝素鈉200U/kg, 5 min后用血管鉗于呼氣末夾閉左側肺門行左肺缺血30min，然后移除血管鉗，行再灌注1h。Sham組只開胸，不建立缺血再灌注模型；I/R 組建立缺血再灌注模型，不吸入H2；H2組建立缺血再灌注模型，并且在再灌注期間吸入67%H2。使用Nano bubble 純水氫氣發生器(上海納諾巴伯納米科技有限公司)產生純度為99%的氫氣。將氫氣和空氣混合后通入密閉箱，在出氣口用氫氣檢測儀(JK40-H2-P，深圳吉順安科技有限公司)通過通氣管路調定氫氣的濃度。

再灌注1h后處死大鼠，取左肺下葉，按重量體積比1 ∶10加入生理鹽水，在4℃進行組織勻漿，4℃ 12000g離心5min，取上清液作為待測樣品。采用黃嘌呤氧化酶法測定上清液中SOD的活性(南京建成生物工程研究所，中國)，采用硫代巴比妥酸法測定上清液中MDA的濃度(南京建成生物工程研究所，中國)；采用ELISA法檢測上清液中IL-6、TNF-α的水平(碧云天生物技術，中國)。提取組織蛋白，采用BCA測定組織蛋白濃度(碧云天生物技術，中國)，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，封閉。采用兔抗cleaved-caspase-3(1 ∶5000; Abcam)、兔抗cleaved-caspase-9(1 ∶5000; Abcam)和兔抗β-actin(1 ∶3000; Abcam)的一抗4℃孵育過夜，用TBST洗膜，孵育二抗，通過凝膠成像分析儀，將PVDF膜上的目的蛋白顯像，拍照，通過Image J 軟件計算其光密度值，并分析目的蛋白/β-actin的比值。

三、統計學方法

結 果

與Sham組比較，I/R 組和H2組上清液IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD活性降低(P<0. 05); 與I/R 組比較，H2組上清液IL-6、TNF-α和MDA水平降低，SOD活性升高(P<0. 05)(見表1)。

表1 三組大鼠炎癥指標和氧化指標的比較

與Sham組比較，I/R 組和H2組 cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白表達明顯升高(P<0. 05); 與I/R 組比較，H2組cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白表達明顯降低(P<0.05)(見圖1～2)。

討 論

肺臟IRI是限制肺移植成功的重要因素，肺臟缺血再灌注產生大量活性氧自由基，進而誘發急性炎癥反應，以及局部浸潤的炎癥細胞釋放大量TNF-α及IL-6等炎癥因子，直接或間接造成肺組織炎癥反應。活性氧自由基具有強烈的氧化作用，導致膜脂質過氧化增強，造成肺組織氧化應激反應[5]。同時，大量產生的活性氧自由基損傷線粒體內膜，細胞色素C被釋放到細胞質中，激活下游的凋亡蛋白caspase-3和caspase-9，進而誘導細胞凋亡[6]。既往研究提示肺臟IRI主要與炎癥反應，氧化應激及細胞凋亡有關[7-10]。本研究參照文獻的方法制備肺缺血再灌注模型[11]。結果表明，I/R 組細胞凋亡明顯升高，IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD活性降低，進一步證實了肺臟IRI與炎癥反應和氧化應激密切相關。因此，有效抑制肺臟缺血再灌注過程中的炎癥反應和氧化應激是減輕肺臟IRI的重要途徑。

圖1 三組大鼠cleaved-caspase-3蛋白表達水平的比較

圖2 三組大鼠cleaved-caspase-9蛋白表達水平的比較

既往研究發現H2在2%～4%濃度范圍內是一種安全和有效的治療氣體，H2對肺損傷具有抗氧化、抗炎癥等效應，但多局限于低濃度(<4%)-[12]。最近有研究發現吸入高濃度(67%)H2能夠緩解哮喘小鼠氣道的炎癥反應和氧化應激損傷[13]，并且發現氫氣的保護作用可能和濃度有關。本研究結果顯示，高濃度氫氣(67%)明顯減少了IL-6、TNF-α和MDA的表達，增加了SOD的活性，明顯減輕了肺臟IRI的細胞凋亡。提示高濃度氫氣對肺臟IRI有保護作用，其機制與抑制炎癥和氧化應激反應有關。

本研究有一定的局限性：(1)本次實驗只檢測了再灌注后1h的結果，時間比較局限，下一步將延長再灌注后的時間以及增加檢測時間點；(2)本次實驗氫氣濃度范圍比較局限，不同濃度的氫氣效果對比需要進一步研究，以確定最適宜的氫氣治療濃度。

綜上所述，高濃度氫氣能夠緩解大鼠肺缺血再灌注的炎癥反應和氧化應激水平，進而減輕大鼠肺缺血再灌注損傷。