血清S100A8/A9與社區獲得性肺炎患者嚴重程度及預后關聯的回顧性隊列研究

馬開樹 劉成坤 屈開新 張威 付林 趙卉

社區獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia, CAP)是指人體處于醫院之外、社區環境中受到細菌、真菌、病毒或混合感染所發生的肺炎，是威脅人類健康的常見感染性疾病之一。流行病學研究表明，全球CAP患者死亡率占住院患者的4%～14%[1-2]。肺炎發展至重癥肺炎時，除了引起呼吸系統的異常反應外，還損傷機體的其他系統，最終可能誘發急性呼吸窘迫綜合癥、膿毒癥以及多器官損傷等[3]。目前，CAP已經成為發展中國家感染性疾病的最主要的死亡原因[3]。雖然病原學和影像學診斷已經取得了巨大發展，各種抗感染治療也降低了CAP患者的ICU入住率，但是CAP患者死亡率一直居高不下。此外，臨床醫生根據經驗診斷CAP的病情容易出現偏差，各種肺炎評分比較復雜、常涉及多個指標的聯合應用，這些客觀條件增加了CAP的病情診斷和治療難度[4]。因此，尋找一種新的、快速的診斷方法或生物標志物對于提高CAP的診治是非常迫切的。

警報素 S100A8和S100A9是S100家族中比較重要的兩個單體蛋白，生理情況下結合形成異源二聚體S100A8/A9進而發揮生物學功能。S100A8/A9作為鈣離子感受器，在中性粒細胞和單核細胞中豐富表達，S100A8/A9常與TLR4以及RAGE等細胞表面受體結合發揮生物學功能[5]。血清S100A8/A9在很多炎癥性疾病中高表達，如慢性阻塞性肺疾病、風濕性關節炎、青少年皮肌炎以及炎癥性腸病[6-8]。但是S100A8/A9是否參與CAP的發生、發展目前并不清楚。本研究擬通過一項回顧性的隊列研究分析血清S100A8/A9水平與CAP患者的嚴重程度和預后之間的關聯，闡述S100A8/A9在CAP疾病進展中的作用。

資料與方法

一、 研究對象

選擇2018年11月至2021年3月就診于阜南縣人民醫院呼吸與危重癥醫學科的CAP患者作為研究對象。所有CAP患者診斷參照《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》[9]，且所有參與者均簽署書面知情同意。排除標準：年齡小于18周歲者；孕婦；嚴重的免疫功能低下患者；合并有惡性的肺部腫瘤或肺結核；精神障礙、依從性較差的患者；住院之前在其他醫院已進行抗生素治療或其他干預。本研究符合醫學倫理學標準，并由阜南縣人民醫院倫理委員會進行認證(FNLL20180012)。

二、 資料收集

收集所有受試者人口學信息，主要包括性別、年齡、BMI、是否合并基礎疾病；收集臨床檢查資料，主要包括血壓、血常規指標、肝功能、腎功能、致病源以及炎癥因子等；CAP嚴重程度按照CAP嚴重性評分(CRB-65、CURB-65、PSI、SMART-COP和CURXO)進行評估。

三、 生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)

利用ELISA的方法檢測血清S100A8/A9(CSB-E12149h)的水平，該試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。檢測前試劑盒室溫下平衡30 min。根據已知標準品濃度建立標準曲線。在預先包被抗體的測試孔中，加入標準品或血清，37℃孵育2 h，震蕩洗板后加入辣根過氧化物酶標記的抗體37℃孵育1 h，然后繼續加入終止液反應15 min，輕輕混勻，使用酶標儀檢測吸光度值。根據已知標準品的濃度和相應吸光度值，繪制標準曲線方程，計算血清S100A8/A9水平。

四、 統計分析

結 果

一、 人口學信息和臨床特征

111名CAP患者被納入該研究，根據CAP患者血清S100A8/A9三分位數水平將所有CAP患者分為三組，分別為低S100A8/A9水平組(低<45.5 pg/mL)、中S100A8/A9組(45.5～110.5 pg/mL)和高S100A8/A9水平組(>110.5 pg/mL)。人口學信息和臨床特征(表1)所示，性別、體重指數、血壓和肝功能指標在三組人群間無差異。年齡、白細胞、中性粒細胞、肌酐、尿素氮、尿酸和IL-6隨著血清S100A8/A9濃度升高逐漸升高；相反，淋巴細胞數隨著CAP患者血清S100A8/A9升高而逐漸減低。此外，基礎疾病在三組CAP患者中無明顯差異。

表1 人口學特征和臨床信息

二、 CAP患者和對照人群，入院血清S100A8/A9的水平

根據CAP嚴重程度評分，將CAP分成不同的等級，比較不同程度CAP患者入院時血清S100A8/A9水平的差異。結果(圖1A)所示，根據CURXO評分將CAP患者分成輕度和重度人群，發現重度CAP患者血清S100A8/A9水平高于輕度患者。依據CURB-65評分，將CAP患者分成三個等級，發現評分為3～5的CAP患者血清S100A8/A9水平高于其他等級CAP患者(圖1B)。此外，參照CRB-65評分，評分≥3的CAP患者血清S100A8/A9水平最高(圖1C)。根據PSI評分將CAP患者分成四個等級，91～130分以及大于130分的CAP患者S100A8/A9水平顯著高于評分低于90分的患者(圖1D)。進一步根據SMART-COP評分分析CAP患者S100A8/A9水平，發現血清S100A8/A9水平隨著SMART-COP評分升高而逐漸升高(圖1E)。

圖1 CAP患者和對照人群血清S100A8/A9水平

三、 不同預后結局CAP患者入院時血清S100A8/A9水平

根據CAP患者的住院時間，將CAP患者分成三組，分別為<9天組，9～16天組以及>16天組。比較不同住院時間CAP患者血清S100A8/A9水平，結果發現隨著住院時間的延長，CAP患者血清S100A8/A9水平是逐漸升高的(圖2A)。CAP患者在入院以后，其中有11(9.91%)名CAP患者死亡，死亡CAP患者在入院時血清S100A8/A9 (223.56±36.56 pg/mL)水平，顯著高于存活患者血清S100A8/A9 (103.32±19.36 pg/mL)水平(圖2B)。

圖2 不同預后結局CAP患者入院血清S100A8/A9水平

四、入院血清S100A8/A9升高與CAP預后結局之間的關聯

進一步分析CAP患者入院時血清S100A8/A9水平與死亡風險之間的關聯，單因素Logistic 回歸分析發現血清S100A8/A9升高增加了死亡風險(OR=1.235, 95% CI：1.042～1.687;P<0.001) (表2)；調整了年齡和性別，控制相關混雜因素后的多因素Logistic回歸分析發現死亡風險與血清S100A8/A9水平依舊呈顯著正相關(OR=1.315, 95% CI：1.115～1.879；P=0.038) (表2)。接下來繼續分析了住院時間與血清S100A8/A9水平的之間的關聯強度，盡管血清S100A8/A9水平與9～16天的住院時間之間無關聯，但是單因素和多因素回歸分析均發現CAP患者入院時血清S100A8/A9水平升高與>16天的住院時間呈顯著正相關(OR=3.215, 95% CI：1.554～4.925，P=0.011；OR=2.354, 95% CI：1.225～6.897，P=0.023)(表2)。

表2 S100A8/A9 水平與 CAP患者預后之間的關聯

五、血清S100A8/A9升高的危險因素

CAP患者血清S100A8/A9水平在入院時是顯著升高的，為了分析血清S100A8/A9升高的危險因素，首先采用了單因素Logistic回歸分析，結果表明年齡、體重指數，以及合并高血壓、糖尿病以及心血管疾病均是血清S100A8/A9升高的危險因素(表3)。多因素Logistic回歸分析表明年齡、合并高血壓是CAP患者入院時血清S100A8/A9升高的危險因素(表3)。

表3 CAP患者血清S100A8/A9升高的危險因素

六、 血清S100A8/A9對CAP嚴重程度和死亡風險的預測效能

血清S100A8/A9對于CAP嚴重程度的預測性能通過受試者工作曲線(ROC曲線)被分析，結果如(圖3A)所示，血清S100A8/A9，CURB-65，CRB-65，PSI，SMART-COP，CURXO以及CAP評分聯合血清S100A8/A9(S100A8/A9+CURB65，S100A8/A9+CRB-65，S100A8/A9+PSI，S100A8/A9+SMART-COP，S100A8/A9+CURXO)對重癥CAP患者的預測性能曲線下面積(AUC)分別為0.821，0.856，0.885，0.920，0.942，0.856，0.945，0.929，0.959，0.986，0.928。血清S100A8/A9水平在截斷值169.56 pg/mL以上可能為重癥CAP，血清S100A8/A9對重癥CAP預測性能的靈敏度和特異度分別為76.8%和83.9%。血清S100A8/A9對于CAP患者的死亡風險被預測，結果如(圖3B、表4)所示，血清S100A8/A9，CURB-65，CRB-65，PSI，SMART-COP，CURXO，S100A8/A9+CURB65，S100A8/A9+CRB-65，S100A8/A9+PSI，S100A8/A9+SMART-COP和S100A8/A9+CURXO對CAP患者死亡風險預測能力分別為0.854，0.657，0.641，0.587，0.674，0.678，0.795，0.835，0.898，0.869和0.868。血清S100A8/A9濃度在截斷值232.68 pg/mL以上可能增加CAP患者的死亡風險，血清S100A8/A9對死亡風險預測效能的靈敏度和特異度分別為83.5%和86.9%。

圖3 血清S100A8/A9水平對CAP的預測效能

表4 不同指標對于CAP患者嚴重程度以及死亡風險的預測性能

討 論

CAP是臨床上常見的呼吸道疾病，是導致住院患者死亡的主要原因之一。受諸多因素的影響，CAP的發生率呈逐漸升高的趨勢，已經成為威脅我國民眾健康和生命安全的重要公共衛生問題。由于CAP發病早期，常會表現出咳嗽、發熱、呼吸困難等癥狀，還伴有腹瀉、心悸等肺外癥狀，發病特征不明顯，容易引起臨床診斷的誤差，因此對CAP患者進行及時而有效的診斷是非常有必要的。

既往研究發現，血清S100A8/A9在很多炎癥性疾病中高表達，如慢性阻塞性肺疾病、風濕性關節炎、青少年皮肌炎以及炎癥性腸病[6-8]。S100A8/A9在急性肺損傷中發揮著重要的作用[10]；L.sigmodontis感染誘發小鼠血清S100A8/A9升高[11]。因此，我們有理由推測S100A8/A9可能參與了CAP進程，但是缺少相關的臨床流行病學和實驗室研究證據。于是，我們檢測了不同嚴重程度CAP患者血清S100A8/A9水平，結果提示隨著CAP患者嚴重程度的加深，血清S100A8/A9水平也是逐漸升高的；回歸分析發現S100A8/A9與CAP患者嚴重程度評分呈正相關。以上結果提示，S100A8/A9可能參與了CAP的發生及發展進程。

本課題也比較了不同住院時間CAP患者血清S100A8/A9水平，結果表明入院時血清S100A8/A9升高的CAP患者住院時間明顯延長；同時也發現死亡患者在入院時血清S100A8/A9水平高于存活患者。于是我們進行了Logistic回歸分析，結果發現入院時血清S100A8/A9的升高，延長了CAP患者住院時間和增加了死亡風險。此外，ROC曲線下面積分析發現盡管單獨的血清S100A8/A9水平與CAP嚴重程度評分對于CAP患者嚴重程度以及死亡風險的預測性能無明顯差異，但是血清S100A8/A9水平聯合CAP嚴重程度評分顯著增加了單獨的血清或CAP嚴重程度評分的預測性能。以上結果表明，入院時血清S100A8/A9升高，增加了CAP患者的不良預后風險。

臨床流行病學研究表明，高齡和合并基礎疾病均加重了CAP患者的嚴重程度[12]。因此，在本課題中人口學因素對于CAP患者血清S100A8/A9升高的影響被分析。單因素Logistic回歸分析發現年齡、體重指數、收縮壓和舒張壓的升高，以及合并高血壓、糖尿病和心血管疾病均是CAP患者血清S100A8/A9升高的危險因素。進一步的多因素Logistic回歸分析表明年齡增加以及合并高血壓是CAP患者入院時血清S100A8/A9升高的獨立危險因素，也是CAP患者不良預后的危險因素。

警報素 S100A8和S100A9在骨髓細胞中豐富表達，在中性粒細胞和單核細胞中合成和分泌，S100A8和S100A9通常形成異源二聚體S100A8/A9進而發揮生物學功能[13]。S100A8/A9作為鈣離子感受器，S100A8/A9可與TLR4以及RAGE等細胞表面受體相結合，S100A8/A9與受體結合以后，可激活NF-κB和AP-1信號促進其核轉位，激活的NF-κB和AP-1信號可進一步發揮轉錄因子的作用，促進下游炎癥因子的合成與分泌[14-15]。因此我們推測，肺炎鏈球菌感染導致肺泡上皮細胞損傷，誘發S100A8/A9的釋放，S100A8/A9的分泌通過與其受體的結合進而激活炎癥信號通路引起炎癥因子釋放，炎癥因子釋放將進一步促進S100A8/A9的分泌，形成一個正反饋環路，不斷誘發S100A8/A9的分泌和促進CAP的發生和發展。

綜上，血清S100A8/A9與CAP患者嚴重程度以及不良預后呈正相關，入院時血清S100A8/A9越高，CAP患者住院時間和死亡風險也顯著升高。此外，年齡增加和合并高血壓是CAP患者入院時血清S100A8/A9升高的危險因素。因此，血清S100A8/A9可能在將來被用作CAP患者嚴重性和預后的一個早期診斷分子標志物。