肺腺癌細胞與血小板共孵育促進HUVEC促凝表型形成

朱婷 董星宇 陳詩雨 吳曉紅 葉明君 李白坤 李慶林

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，肺腺癌則是較為多見的肺癌類型[1]。研究顯示，高凝狀態(tài)及其所致的血栓栓塞是影響肺癌病人治療效果的重要因素[2]；因為血液高凝狀態(tài)不但可增強循環(huán)癌細胞的存活力，還會增強循環(huán)癌細胞向血管內皮細胞(VEC)的黏附力，為癌細胞進一步實現(xiàn)跨內皮遷移提供便利[3]。導致癌癥患者血液高凝狀態(tài)的原因復雜，進入血管的癌細胞可通過活化血小板和(或)血管內皮細胞等，促進高凝狀態(tài)形成[4]。同時，活化血小板又可將癌細胞包裹起來增強其存活力，并介導癌細胞向VEC黏附等[5]。因此，肺腺癌細胞與血小板共孵育后，可能會增加VEC損傷和促凝表型形成，但相關研究卻非常鮮見。本文采用共培養(yǎng)體系模擬體內微環(huán)境，觀察肺腺癌細胞H1299與血小板串擾對VEC促凝表型形成的作用。

資料與方法

一、 材料和試劑

人肺腺癌細胞株(H1299)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)均來自安徽中醫(yī)藥大學科研技術中心。β-actin(Abbkine)，細胞間黏附分子(ICAM-1)(absin), 血管細胞黏附分子(VCAM-1)(Affinity)，P-選擇素受體(PSGL-1)(Bioss)。山羊抗兔IgG(absin)，山羊抗鼠IgG(absin)，1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(維森特生物技術有限公司)，雙抗、胰酶(碧云天)，CGS緩沖液(氯化鈉3.6g、D-葡萄糖3.3g、檸檬酸鈉2.165g，試劑溶解于95mL超純水，調節(jié)PH至6.5，定容至500mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，0.22um濾頭過濾，37℃水浴預熱)。

二、 實驗方法

本研究獲得安徽省中醫(yī)院倫理委員會批準(2020AHZY-01)。

1 細胞培養(yǎng)

HUVEC和H1299細胞復蘇后，置于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，取狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

2 洗滌血小板制備

取健康成年志愿者靜脈全血10mL，枸櫞酸抗凝，200g離心20min后，吸出富血小板血漿，800g離心10min后，棄上清，以預熱過濾后的CGS重懸PLT沉淀，600g離心5min，洗滌3次后，以預熱的無血清培養(yǎng)基重懸血小板，將濃度調至3.0×108個/mL后進行實驗研究。

3 條件培養(yǎng)基制備

H1299條件培養(yǎng)基(CM_H)制備：H1299細胞長至70%～80%密度時，更換含1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取上清，3000r/min離心10min，0.22um微孔過濾后，-20℃保存?zhèn)溆?。H1299和血小板共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基制備(CM_HP)：H1299細胞長至70%～80%密度時，更換含1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，同時加入洗滌血小板(血小板：瘤細胞=200)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取上清，3000r/min離心10min，0.22um微孔過濾后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 鬼筆環(huán)肽染色

取狀態(tài)良好的HUVEC接種于24孔板爬片，加入不同種類條件培養(yǎng)基孵育24h后，取出24孔板，PBS洗3遍，每次5min，多聚甲醛固定20min，PBS洗3遍，每次5min， 0.1%曲拉通透化5min，PBS洗3遍，每次5min，每孔加入FITC-鬼筆環(huán)肽染色液200 uL，室溫避光染色20min，棄染色液，PBS洗3遍，每次5min，DAPI染色10min，PBS洗3遍，每次5min，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

5 酶聯(lián)免疫吸附測定

將CM_H、CM_HP和PLT分別作用于HUVEC，24h后收集上清，按照ELISA試劑盒說明書配置標準品，測定上清中的PS含量，450nm處測定OD值，根據(jù)標準曲線計算不同上清中的PS水平。

6 蛋白免疫印跡法

收集處理過的各組細胞，冰上裂解，提取細胞中總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，與Loading buffer混合，100℃，10 min煮沸，進行SDS凝膠電泳，200mA，轉膜2h，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，放入一抗，4℃條件下過夜，次日取出，與山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG室溫孵育2h，TBST漂洗后，曝光，以β-Actin為內參分析蛋白表達水平。

三、 統(tǒng)計學方法

結 果

一、 H1299和血小板共培養(yǎng)促進HUVEC骨架改變

細胞骨架是調控細胞運動的重要因素，鬼筆環(huán)肽染色后采用激光共聚焦顯微鏡可觀察細胞骨架的改變情況。研究結果顯示，HUVEC組細胞骨架排列清晰，呈絲網(wǎng)狀；HUVEC+CM_H組邊緣不光滑，細胞骨架排列不清晰；HUVEC+CM_HP組細胞骨架排列不清晰，微絲部分缺失，出現(xiàn)絲狀偽足，HUVEC+PLT 組，HUVEC邊緣光滑，微絲有所減少，細胞形態(tài)有所變化(見圖1)。

圖1 鬼筆環(huán)肽染色的HUVEC細胞骨架(激光共聚焦顯微鏡，×100)

二、H1299和血小板共培養(yǎng)促進HUVEC上清PS的表達

由(圖2)可見，4組的PS表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=31.17，P<0.001)；且HUVEC+CM_HP組(2.66±0.06)的表達量高于HUVEC組(2.15±0.04)、HUVEC+CM_H組(2.26±0.07)和HUVEC+PLT組(2.34±0.05)，HUVEC+PLT組PS表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 HUVECPS的表達水平

三、H1299和血小板共培養(yǎng)促進HUVEC ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1的表達

ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1在HUVEC處于靜息狀態(tài)時低表達，與肺腺癌細胞和血小板共存時高表達。由(圖3)可見，CM_HP可促進HUVEC上述三種蛋白的表達，且各組間蛋白的表達差異均有統(tǒng)計學意義(ICAM-1：F=142.60，PSGL-1：F=56.53，VCAM-1：F=147.90，P<0.001)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，HUVEC+CM_HP組ICAM-1表達量(2.57±0.11)高于HUVEC(1.00±0.03)、HUVEC+CM_H(1.23±0.08)和HUVEC+PLT組(1.40±0.09)；HUVEC+CM_H和HUVEC+PLT組ICAM-1表達量均高于HUVEC組(P<0.001)。類似的，HUVEC+CM_HP組的PSGL-1(1.98±0.13)表達量高于HUVEC(1.00±0.02)、HUVEC+CM_H(1.26±0.07)和HUVEC+PLT組(1.34±0.04)；HUVEC+CM_HP組的VCAM-1(2.93±0.12)表達量也高于HUVEC(1.00±0.03)、HUVEC+CM_H組(1.12±0.05)和HUVEC+PLT組(1.17±0.16)(P<0.001)。提示，肺腺癌細胞和血小板共孵育，可能促進了內皮細胞黏附分子的表達，有利于內皮細胞促凝表型形成。

圖3 H1299和血小板共孵育上調的ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1 蛋白表達量

討 論

轉移是導致肺腺癌治療失敗的主要原因之一[6]，探究影響肺癌發(fā)生轉移的因素，有利于針對性地進行干預。研究表明，內皮細胞促凝表型的形成可能與PS外翻有關[7]，促凝表型的主要特征是細胞骨架改變，并伴隨ICAM-1、PSGL-1和VCAM-1等黏附分子表達量增加等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞和血小板自身，都具有一定的促進內皮細胞黏附蛋白表達的作用[8]?？紤]到肺腺癌細胞可活化血小板，活化并結合內皮細胞，血小板對肺癌的轉移具有重要作用[9]，血小板可促進肺癌細胞的活力與增殖，促進腫瘤生長[10]；因此，肺腺癌細胞與血小板共培養(yǎng)，可能促進內皮細胞形成促凝表型[11]。

本研究結果顯示，與H1299和血小板共孵育后，內皮細胞骨架發(fā)生改變、上清中PS的表達量以及內皮細胞中的幾種黏附分子表達量均顯著增加；而單獨與肺腺癌細胞或血小板共孵育的內皮細胞骨架改變情況、PS和黏附分子表達也較單純內皮細胞組增加，但程度明顯低于H1299和血小板共孵育組。提示，與H1299細胞和血小板共培養(yǎng)可能通過某種途徑，促進了內皮細胞結構的改變和相關分子的表達，進而誘發(fā)HUVEC促凝表型形成；研究結果同Chuang P.C.以及Falanga A.的研究結果相似[5,12]。但也有研究提示活化的血小板可通過保護內皮細胞免受腫瘤細胞的滲透而抑制腫瘤轉移[8]。出現(xiàn)這種不一致現(xiàn)象的原因目前尚不完全清楚，可能與細胞株和實驗條件等不同有關[13]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)與H1299細胞和血小板共培養(yǎng)可能為內皮細胞促凝表型的形成提供了便利，抑制腫瘤細胞-血小板-血管內皮細胞間的相互作用，可能有助于改善肺腺癌的高凝狀態(tài)，抑制腫瘤細胞跨內皮遷移的實現(xiàn)，進而降低腫瘤轉移風險。誠然，本研究結果還有待進一步開展動物實驗和臨床試驗去深入探究。